袁永一 戴樸

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所聾病分子診斷中心(100853北京)

2國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

3聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

4聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了遺傳性耳聾分子病因的揭示，使早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)攜帶者及遺傳風(fēng)險(xiǎn)成為現(xiàn)實(shí)，基于精準(zhǔn)診斷的預(yù)防干預(yù)有效阻斷了遺傳性耳聾在家庭內(nèi)的垂直傳遞。不斷改進(jìn)的分子診斷技術(shù)一方面帶來不斷提高的檢出率，另一方面也面臨著新檢測(cè)技術(shù)所帶來的數(shù)據(jù)分析的困難和變異解讀的不確定性等問題。如何合理利用新的檢測(cè)技術(shù)、提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本是臨床醫(yī)生和患者家庭共同關(guān)心的問題。本文就遺傳性耳聾診斷、篩查的適用人群、原則、策略進(jìn)行初步探討，期望促進(jìn)相關(guān)工作的規(guī)范化開展。

1 耳聾基因診斷方法和檢測(cè)基因范圍的選擇

用于遺傳性耳聾診斷的主要方法包括基因芯片、基因Sanger測(cè)序、目標(biāo)耳聾基因靶向捕獲測(cè)序、全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing,WES）及全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)等。后三種以下一代測(cè)序（next-generation sequencing,NGS）技術(shù)為基礎(chǔ)。目前臨床上應(yīng)用較多的是前三種，WES和WGS在遺傳性耳聾科研領(lǐng)域應(yīng)用較多。近年來，目標(biāo)耳聾基因靶向捕獲測(cè)序和WES逐漸成為遺傳性耳聾診斷的重要工具。這兩種檢測(cè)手段雖然有效，卻仍然存在不能檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異（structural variations,SV）的技術(shù)限制。WGS對(duì)受檢者基因組中的全部DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，較WES所覆蓋的區(qū)域更廣，不僅覆蓋了幾乎全部基因的外顯子序列，也覆蓋了內(nèi)含子序列和基因間序列?，F(xiàn)在認(rèn)為WGS可有效避免在對(duì)相關(guān)基因組區(qū)域進(jìn)行靶向富集時(shí)產(chǎn)生的技術(shù)偏差，不僅可以檢出單核苷酸變異（single nucleotide variations,SNV），還可以對(duì)SV進(jìn)行分析，并常規(guī)性地對(duì)線粒體基因組（mitochondrial genome DNA,mtDNA）變異進(jìn)行分析[1,2]。WGS應(yīng)用于臨床遺傳診斷有望提高診斷率，縮短診斷流程，節(jié)省時(shí)間及降低診療費(fèi)用[3]。

下一代測(cè)序有效服務(wù)耳聾基因診斷不僅依賴于檢測(cè)技術(shù)的更新，還與數(shù)據(jù)分析、變異解讀密不可分。越來越多的檢測(cè)中心開始采用美國分子病理學(xué)會(huì)（Association of Molecular Pathology,AMP）和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American college of medical genetics and genomics,ACMG）提出的指南，但這些指南都是自愿依從的，而且隨著正常對(duì)照及疾病變異數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)大，某些臨床意義不明的變異的致病性也在更新中。即使使用相同的解讀框架，不同實(shí)驗(yàn)室的病理學(xué)家也存在分歧，甚至在某些情況下，對(duì)于同一個(gè)變異的致病性，不同機(jī)構(gòu)會(huì)有不同的結(jié)論。此外，無論是WES還是WGS，其主要目的是揭示可解釋患者臨床表型的致病基因（組）變異，但在部分個(gè)體基因組中還可能檢測(cè)出與受檢指征不相關(guān)但具有重要臨床功效性（主要是指能較好預(yù)測(cè)未來發(fā)病的可能并可進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)或治療）的基因（組）變異。當(dāng)這些變異是無意中被發(fā)現(xiàn)時(shí)，被稱為意外發(fā)現(xiàn)[4]。ACMG建議有意識(shí)地分析這些有重要臨床意義的基因（組）變異，并將稱其為次要發(fā)現(xiàn)[5]。意外發(fā)現(xiàn)和次要發(fā)現(xiàn)雖然一方面為檢測(cè)者提供了有用的遺傳信息，但同時(shí)也會(huì)不同程度地增加檢測(cè)者的精神壓力和心理負(fù)擔(dān)，為遺傳咨詢帶來更多挑戰(zhàn)[6,7]。

關(guān)于診斷手段的選擇，對(duì)于基因型表型對(duì)應(yīng)性明確的遺傳性耳聾類型，可以有針對(duì)性地進(jìn)行基因檢測(cè)，比如對(duì)顳骨CT顯示前庭水管擴(kuò)大患者直接進(jìn)行SLC26A4基因檢測(cè)、耳聾甲發(fā)育不全綜合征患者進(jìn)行ATP6V1B2基因檢測(cè)、內(nèi)耳畸形IP-Ⅲ檢測(cè)POU3F4基因。對(duì)于表型特征明確的常見綜合征型耳聾或有遺傳線索的聽神經(jīng)病可以申請(qǐng)包含其相關(guān)基因的檢測(cè)（表1）。醫(yī)生對(duì)表型的認(rèn)識(shí)決定了選擇基因檢測(cè)范圍的準(zhǔn)確性及全面性。在檢測(cè)費(fèi)用相當(dāng)?shù)那闆r下，選擇包含更多耳聾基因的Panel檢測(cè)性價(jià)比更高；考慮到患者的經(jīng)濟(jì)條件，也可以進(jìn)行階梯遺傳檢測(cè)，即常見耳聾基因測(cè)序（GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，三者在中國感音神經(jīng)性耳聾兒童群體確診率達(dá)44%）、已知耳聾基因捕獲測(cè)序Panel、WES等，一旦常見耳聾檢測(cè)診斷明確了病因則可以直接進(jìn)入檢測(cè)后遺傳咨詢，但如果常見耳聾檢測(cè)陰性再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)將延長診斷流程，提高診療費(fèi)用。

耳聾基因檢測(cè)前知情同意的內(nèi)容包括：（1）送檢的目的及意義；（2）檢測(cè)方法、周期及局限性；（3）預(yù)期結(jié)果及可能的風(fēng)險(xiǎn)：檢測(cè)結(jié)果可能為陽性，即在與受檢者耳聾相關(guān)的基因中找到致病性變異；陰性，即未發(fā)現(xiàn)與受檢者耳聾相關(guān)的致病性變異；或結(jié)果不確定，即在與受檢者表型相關(guān)的基因中找到意義不明的變異，或在與受檢者表型可能相關(guān)但是不確定的基因中找到致病性變異。受檢者應(yīng)知悉次要發(fā)現(xiàn)的可能及其意義和風(fēng)險(xiǎn)；（4）數(shù)據(jù)及樣本處理的相關(guān)規(guī)則；（5）數(shù)據(jù)再分析的可能性。

2 新生兒耳聾基因篩查

新生兒耳聾基因篩查與聽力篩查聯(lián)合開展，可以相互補(bǔ)充。不僅可以發(fā)現(xiàn)先天性耳聾，還可以發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性語前聽力損失，提出預(yù)警，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)；不僅能第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)耳聾，還可明確分子病因，提高早期診斷水平[8]；新生兒耳聾基因篩查能發(fā)現(xiàn)更多的母系遺傳藥物性耳聾易感個(gè)體，通過科學(xué)的用藥指導(dǎo)可有效避免個(gè)體藥物性耳聾的發(fā)生；對(duì)基因篩查發(fā)現(xiàn)的隱性遺傳基因突變攜帶者，給予早期遺傳咨詢，對(duì)未來其子代發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)給予第一時(shí)間預(yù)警。也就是說，新生兒耳聾基因篩查同時(shí)發(fā)揮了攜帶者篩查的作用，而且把攜帶者篩查提早到剛出生。

關(guān)于新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的處理原則見圖1。

圖1新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的處理原則Fig.1 Management priciple of concurrent hearing and genetic screening in newborns

表1常見耳聾綜合征及遺傳性聽神經(jīng)病基因列表Table 1 Gene list of common syndromic hearing loss and hereditary auditory neuropathy

3 攜帶者篩查

攜帶者篩查（carrier screening)是用來檢測(cè)每對(duì)夫妻遺傳風(fēng)險(xiǎn)的基因檢測(cè)。在懷孕前或孕期，了解夫婦雙方攜帶致病變異的風(fēng)險(xiǎn)，能夠給夫妻提供合理的生育指導(dǎo)，是基因組技術(shù)應(yīng)用于有效預(yù)防或管理出生缺陷和罕見遺傳疾病的重要措施。最初，攜帶者檢測(cè)針對(duì)一些嚴(yán)重隱性遺傳疾病在一些有較高攜帶率的種族或人群∕地區(qū)開展。最早的在孕期女性中開展得耳聾攜帶者篩查文章發(fā)表于2013年[9]，篩查針對(duì)已知耳聾基因致病變異。孕婦耳聾基因篩查屬于遺傳性耳聾二級(jí)預(yù)防范疇，將遺傳性耳聾的診斷從新生兒提早到胎兒期，在預(yù)防耳聾出生缺陷方面發(fā)揮了重要作用。目前存在問題如下：篩查時(shí)間過晚，孕婦拿到結(jié)果時(shí)在孕中期或更晚，攜帶者孕婦配偶的基因檢測(cè)完成后，一旦確認(rèn)胎兒耳聾高風(fēng)險(xiǎn)，因孕周較晚，家庭選擇引產(chǎn)雖避免了耳聾患兒出生，但給孕婦帶來嚴(yán)重身心損傷；部分婦產(chǎn)機(jī)構(gòu)雖開展耳聾攜帶者篩查，但對(duì)篩查意義認(rèn)識(shí)不足、結(jié)果解讀不深入，由此導(dǎo)致陽性孕婦轉(zhuǎn)診及配偶的進(jìn)一步檢測(cè)延誤；還未在全國范圍普遍開展。

從耳聾一級(jí)預(yù)防的理念出發(fā)，孕前是為攜帶者篩查的最佳時(shí)間節(jié)點(diǎn)。備孕期間可以一方先篩查，如果結(jié)果陽性，配偶則要進(jìn)一步檢查。配偶的檢查應(yīng)針對(duì)攜帶致病變異的一方的基因進(jìn)行全面測(cè)序，一旦發(fā)現(xiàn)致病變異攜帶，則確定為生育耳聾高風(fēng)險(xiǎn)家庭。對(duì)于孕前篩查發(fā)現(xiàn)耳聾高風(fēng)險(xiǎn)家庭，可以采用胚胎植入前診斷或產(chǎn)前診斷避免耳聾患兒出生。

關(guān)于攜帶者篩查的基因及變異數(shù)目是值得討論的問題。完整的人類基因組參考序列的完成，隨后DNA測(cè)序和基因芯片技術(shù)的速度和成本的顯著提高，使得在當(dāng)前進(jìn)行產(chǎn)前∕孕前遺傳病篩查和臨床遺傳病診斷獲得了前所未有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與質(zhì)量保證。但是，高通量篩查帶來的潛在危險(xiǎn)也應(yīng)加以考慮和解決。關(guān)于輕度表型，不同表現(xiàn)度，低外顯率和成年期才發(fā)病的信息應(yīng)該完整、透明地傳遞給受試者，允許受試者不勾選這些檢測(cè)選項(xiàng)。在得到陰性檢測(cè)結(jié)果之后，還必須讓受試者了解殘余風(fēng)險(xiǎn)的概念。商業(yè)化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室有義務(wù)參與并促進(jìn)這種信息傳遞。具體到耳聾，GJB2c.109G＞A突變作為篩查位點(diǎn)時(shí)應(yīng)向篩查對(duì)象將其可能引起的表型變異特征清楚說明，并對(duì)該突變即便篩查陽性也不建議產(chǎn)前診斷的信息向篩查對(duì)象傳遞。

顯然擴(kuò)大篩查的基因及變異位點(diǎn)，能提高檢出率，但納入更多位點(diǎn)也可能會(huì)出現(xiàn)一些變異臨床意義解釋不清的情況，使得遺傳咨詢師和患者∕攜帶者都處于兩難的境地。此外，擴(kuò)大篩查范圍也會(huì)增加檢測(cè)成本（包括試劑、人力分析等方面）。我們認(rèn)為，對(duì)一些極其罕見的耳聾基因變異進(jìn)行篩查不符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)罕見常染色體隱性遺傳病攜帶者，配偶同時(shí)攜帶相同基因的致病突變的機(jī)會(huì)較低，生育患病后代的風(fēng)險(xiǎn)很低，而且一旦診斷攜帶者可能會(huì)使患者誤認(rèn)為自己不健康，增加不必要的精神負(fù)擔(dān)，遺傳咨詢師要花費(fèi)比較多的時(shí)間精力去解釋、增加工作量。因此，對(duì)于篩查耳聾基因變異范圍來說，并非越多越好，以既能夠篩查出耳聾風(fēng)險(xiǎn)、降低子代患病率、達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的，又能符合經(jīng)濟(jì)效益原則，且不給醫(yī)患雙方帶來更多的工作和精神壓力為準(zhǔn)。

結(jié)合ACMG對(duì)攜帶者篩查的立場(chǎng)[10]，我們對(duì)耳聾攜帶者篩查選取的基因變異位點(diǎn)建議如下：

1.耳聾攜帶者篩查結(jié)果中確定的多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高的受檢者及其伴侶將考慮進(jìn)行產(chǎn)前診斷，有助于生殖的決策。對(duì)于那些以可變表現(xiàn)度或不完全外顯率為特征的疾病、已知與輕度表型相關(guān)的疾病應(yīng)該是可選的（不強(qiáng)制），并且在使用這些技術(shù)進(jìn)行篩查時(shí)應(yīng)該是透明的。這項(xiàng)建議是以無害的道德原則為指導(dǎo)的；

2.當(dāng)導(dǎo)致成年后發(fā)生的耳聾的基因（可能會(huì)影響受試者子女成年后的患病風(fēng)險(xiǎn)）包括在篩查疾病列表中時(shí)，必須向受試者說明并獲得同意篩查這些疾病，尤其是在受試者或其他家庭成員可能已經(jīng)有相關(guān)癥狀提示的時(shí)候。這項(xiàng)建議遵循自主和無害的道德原則；

3.對(duì)于篩查的每個(gè)致病基因變異的頻率應(yīng)該在被檢測(cè)的人群中是已知的，從而可以評(píng)估檢測(cè)陰性的個(gè)體中有意義的殘留風(fēng)險(xiǎn)；

4.所檢測(cè)的變異與耳聾嚴(yán)重程度之間必須有確認(rèn)的臨床關(guān)聯(lián)。

4 檢測(cè)后遺傳咨詢

無論是耳聾基因篩查還是診斷，檢測(cè)后均應(yīng)給予受檢方相應(yīng)的檢測(cè)后遺傳咨詢，就檢測(cè)的意義及結(jié)果進(jìn)行解釋和教育，輔導(dǎo)其進(jìn)行知情選擇，使其對(duì)所患疾病及其再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有所認(rèn)知和接受，并提供有關(guān)的治療、求助渠道、預(yù)防子代耳聾風(fēng)險(xiǎn)的方案等信息。

檢測(cè)后咨詢內(nèi)容可以以全基因組測(cè)序在遺傳病檢測(cè)中的臨床應(yīng)用專家共識(shí)中的建議為框架[6]，具體包括是否可就檢測(cè)結(jié)果做出明確的基因診斷或明確受檢者是否為耳聾基因突變攜帶者；是否需要針對(duì)性的輔助檢查來進(jìn)一步明確檢出變異的致病相關(guān)性，尤其是對(duì)意義不明的變異；是否需要進(jìn)一步對(duì)受檢者或家庭成員進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證或排除診斷；根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，是否需進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)，明確藥物禁忌等；根據(jù)做出的基因診斷對(duì)患者的病情預(yù)后發(fā)展等進(jìn)行評(píng)估，制定治療及隨訪觀察計(jì)劃；對(duì)患者和家屬提供心理干預(yù)或社會(huì)救助資源和渠道等；根據(jù)遺傳規(guī)律對(duì)父母的再生育風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估及其再生育指導(dǎo)，包括產(chǎn)前診斷或胚胎植入前診斷等；患者或先證者的下一代風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其再生育指導(dǎo)；家族內(nèi)其他家庭成員的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；疾病的有關(guān)研究進(jìn)展信息等。需注意的是，如受檢方要求進(jìn)行產(chǎn)前診斷或輔助生殖等，則需根據(jù)相關(guān)共識(shí)或指南明確告知風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)行相應(yīng)的指導(dǎo)或咨詢。

針對(duì)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)的報(bào)告進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)，醫(yī)生應(yīng)先針對(duì)檢測(cè)質(zhì)量、報(bào)告中變異評(píng)估證據(jù)、可疑變異一代測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果、變異在家系中是否與耳聾表型共分離等做出綜合評(píng)估，如果檢測(cè)結(jié)果可靠，再向患者進(jìn)行結(jié)合其表型與檢測(cè)結(jié)果的遺傳咨詢。如果遇到檢測(cè)報(bào)告信息提供不全或結(jié)果有爭議的情況，要申請(qǐng)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供更全面的信息、甚至修正結(jié)果后再進(jìn)行遺傳咨詢。

5 展望

耳聾是常見的出生缺陷，超過60%的語前聾是由遺傳因素導(dǎo)致的，明確遺傳致病因素是耳聾精準(zhǔn)診治干預(yù)的前提和基礎(chǔ)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，耳聾基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了高通量、低成本，為其普及推廣創(chuàng)造了條件。目前，我國耳聾基因診斷、產(chǎn)前診斷工作穩(wěn)步開展，實(shí)施中仍面臨諸多問題，如檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)質(zhì)量水平參差不齊，缺乏標(biāo)準(zhǔn)；檢測(cè)報(bào)告尚未形成規(guī)范，變異解讀不夠明確；檢測(cè)機(jī)構(gòu)和∕或臨床醫(yī)生對(duì)報(bào)告解讀不深入，無法提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢服務(wù)；缺乏疑難病例轉(zhuǎn)診、會(huì)診體系及流程；缺乏耳聾疾病生物數(shù)據(jù)錄入、存儲(chǔ)、整合、共享機(jī)制等。上述不足極大地影響了耳聾分子大數(shù)據(jù)總結(jié)、耳聾家庭再生育指導(dǎo)及患者的精準(zhǔn)治療評(píng)估，給耳聾患者及家庭帶來了不必要的損失。因此，有必要開展全國范圍內(nèi)的臨床多中心研究，規(guī)范工作流程、優(yōu)化檢測(cè)手段、構(gòu)建耳聾基因數(shù)據(jù)庫，提升耳聾基因篩查與診斷的整體水平，真正做到為耳聾患者精準(zhǔn)服務(wù)。