王淑娟 梁鵬飛 李瓊 李薇 王劍 查定軍

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

耳聾是全世界最常見的殘疾之一，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也嚴(yán)重影響了患者及其家人的生活質(zhì)量。引起耳聾的病因分遺傳因素和環(huán)境因素，其中遺傳因素占60%[1]。遺傳性聾具有高度異質(zhì)性，已報(bào)道的與聽力下降相關(guān)的基因超過(guò)130個(gè)（http:∕hereditaryhearingloss.org），在我國(guó)最常見的耳聾基因是GJB2、SLC26A4、mtDNA 12SrRNA、GJB3四個(gè)基因[2]。文獻(xiàn)報(bào)道TMIE基因?yàn)橐阎@致病基因，是DFNB6的致病責(zé)任基因。疾病表現(xiàn)為語(yǔ)前聾。本文通過(guò)芯片捕獲高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)出一例TMIE基因變異患者，通過(guò)Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)該近親婚配家系核心成員進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)驗(yàn)證，明確了先證者及家庭成員耳聾的病因，為該家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 家系資料

本研究家系的調(diào)查由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科完成，對(duì)該項(xiàng)目的倫理論證由空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可。家系成員居住地為甘肅省，漢族，先證者父母為近親婚配。本項(xiàng)目對(duì)家庭成員進(jìn)行詳細(xì)的問(wèn)詢，包括基本信息、先證者耳聾相關(guān)病史、既往史、家族史以及先證者母親孕期身體狀況、用藥史、外傷史等?；颊呒捌浼覍賹?duì)本研究了解并簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 聽力學(xué)檢查及聽力學(xué)表型的分析

先證者及核心家系成員進(jìn)行了純音聽閾檢測(cè)。觀察先證者及其父親行走姿態(tài)，初步排除了共濟(jì)失調(diào)或步態(tài)不穩(wěn)等前庭功能異常的癥狀。通過(guò)詢問(wèn)病史排除了外傷、用藥、噪音等風(fēng)險(xiǎn)因素。根據(jù)家系調(diào)查和聽力結(jié)果繪制系譜圖（見圖1）。

圖1家系圖譜Fig.1 Pedigree map

1.2.2 DNA提取

采集家系中VI:1、V:1、V:5的外周血3ml，EDTA抗凝，康為世紀(jì)生物科技公司FlexGen Blood DNA Kit試劑盒提取血液基因組DNA，Nanodrop微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，取適量樣本稀釋至濃度為100～200ng/μl后，其余-20℃保存。

1.2.3 目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序

應(yīng)用已知遺傳性聾基因捕獲試劑盒，對(duì)遺傳性聾相關(guān)基因編碼區(qū)及附近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行靶向測(cè)序，包括86個(gè)非綜合征型耳聾相關(guān)基因，46個(gè)綜合征型耳聾相關(guān)基因，20個(gè)聽神經(jīng)病相關(guān)基因及27個(gè)耳聾相關(guān)需鑒別診斷基因，部分基因有臨床異質(zhì)性，共計(jì)167個(gè)基因。具體方法：將基因組DNA用DNA酶切至200～300bp范圍的片段準(zhǔn)備構(gòu)建文庫(kù)。對(duì)這些DNA片段按照Illumina的規(guī)定進(jìn)行末端修復(fù)及添加Illumina適配元件。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，生物素標(biāo)記的單鏈DNA捕獲探針與文庫(kù)DNA雜交，磁珠吸附抓取目標(biāo)基因，洗脫純化富集。獲取的基因片段文庫(kù)加載到測(cè)序芯片F(xiàn)lowcell上，在Illumina NextSeq 500測(cè)序儀上對(duì)167個(gè)耳聾相關(guān)基因外顯子進(jìn)行高通量測(cè)序，此項(xiàng)工作由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。

數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)處理按照標(biāo)準(zhǔn)Illumina程序進(jìn)行。首先進(jìn)行去除adaptor、低質(zhì)量reads、短序列等數(shù)據(jù)預(yù)處理。BWA將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與人基因組NCBI37∕hg19進(jìn)行比較。GATK軟件包中的工具檢測(cè)SNV、SNP和INDEL。ANNOVAR工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。使用千人基因組頻率數(shù)據(jù)庫(kù)（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕variation∕tools∕1000genomes）、人類疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕clinvar），DVD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http:∕deafnessvariationdatabase.org），dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)（https:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕snp）進(jìn)行篩選、注釋。其中SIFT∕PolyPhen2 軟件用來(lái)預(yù)測(cè)SNP改變的蛋白是否會(huì)影響功能。各個(gè)變異位點(diǎn)嚴(yán)格按照ACMG指南進(jìn)行致病性分析。

1.2.4 突變驗(yàn)證

家系核心成員驗(yàn)證：采用PCR、Sanger測(cè)序的方法對(duì)家系成員進(jìn)行變異檢測(cè)，驗(yàn)證該變異與表型的相關(guān)度；引物設(shè)計(jì)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene ID:259236），上游引物：5’-AGGAGATCGAAGCCCGGTAC-3’，下游引物：5’-CTTCACAGCCACTGCCATCC-3’。PCR反應(yīng)體系：天根生化科技(北京)有限公司的2×Pfu PCR MasterMix(KP201)25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 22μl，總體系50μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性 30sec，59℃退火 30sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min后，4℃保存。行瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物，由西安擎科生物技術(shù)有限公司完成雙向測(cè)序。家系外驗(yàn)證，分析了53例散發(fā)非綜合征型耳聾患者的高通量測(cè)序結(jié)果，并通過(guò)Sanger測(cè)序方法對(duì)100例聽力正常的健康個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)以排除多態(tài)性位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 聽力學(xué)結(jié)果

先證者(VI:1)，男，32歲，先天性聾；父親(V:1)同樣為先天性聾，母親（V:5）聽力正常。對(duì)先證者核心家系進(jìn)行純音測(cè)聽檢測(cè)，先證者純音測(cè)聽平均聽閾：右耳111dB，左耳96dB。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年耳聾分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，先證者及其父親均診斷為雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，純音聽閾結(jié)果詳見表1。

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果

先證者TMIE檢測(cè)出c.458_462delAAGGA純合變異，變異位置位于3’末端附近，示意圖見圖2。變異信息詳見表2。我實(shí)驗(yàn)室53例散發(fā)患者測(cè)序未發(fā)現(xiàn)TMIE基因變異。

圖2 TMIE示意圖[3]，箭頭指向致病變異位置Fig.2 Schematic representation of TMIE[3],Arrows point to the location of the pathogenic variant

2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

先證者Sanger測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。按照最靠近3’端法則，先證者明攜帶TMIE基因c.458_462delAAGGA純合變異；先證者父親攜帶TMIE基因c.458_462delAAGGA純合變異；先證者母親攜帶TMIE基因c.458_462delAAGGA雜合變異。詳見圖3。100名聽力正常人檢測(cè)結(jié)果為陰性。c.458_462delAAGGA導(dǎo)致終止密碼子喪失p.K153Rfs*115引起蛋白質(zhì)長(zhǎng)度變化。根據(jù)ACMG指南PM2+PM3+PM4+PP1+PP4，該變異初步判定為致病性變異。PM2：數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)的變異（或隱性遺傳病中極低頻位點(diǎn)）；PM3：隱性遺傳病，此位點(diǎn)為純合變異；PM4：非重復(fù)區(qū)框內(nèi)插入∕缺失或終止密碼子喪失導(dǎo)致的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度變化；PP1：突變與疾病在家系中共分離；PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。

圖3家系成員的Sanger測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sanger sequencing results of family members

3 討論

TMIE基因是一種內(nèi)耳跨膜蛋白，位于3p21.31，共包括4個(gè)外顯子，編碼156個(gè)氨基酸、約17kDa的蛋白，由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞外的環(huán)構(gòu)成。2002年Naz等[4]根據(jù)Mitchem等[5]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在重度及極重度語(yǔ)前聾DFNB6家系的患者中檢測(cè)到TMIE基因致病性變異，表明TMIE基因與人類耳聾相關(guān)。通過(guò)酵母雙雜交篩選，TMIE蛋白被鑒定與PCDH15和TMHS相結(jié)合[6]，進(jìn)一步的研究顯示TMIE蛋白位于纖毛的頂端與PCDH15的剪接變異體(PCDH15-CD2)結(jié)合形成復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體與毛細(xì)胞的機(jī)械能轉(zhuǎn)換為生物電能的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)[6,7]。在Tmie缺陷耳蝸毛細(xì)胞中，即使尖端，也不能檢測(cè)到電流[6]。TMIE蛋白的羧基端片段包含與PCDH15相互作用的結(jié)構(gòu)域，過(guò)度表達(dá)TMIE蛋白的羧基端片段會(huì)擾亂TMHS∕LHFPL5的轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。

表1 家系核心成員純音聽閾結(jié)果Table 1 Audiometry findings

表2高通量測(cè)序結(jié)果分析Table 2 Analysis of next-generation sequencing

本研究中的變異位點(diǎn)c.458_462delAAGGA，在人群中的攜帶率極低，檢出者是無(wú)任何臨床表現(xiàn)僅攜帶單雜合變異的聽力正常人。在本研究發(fā)現(xiàn)此變異靠近3’末端，造成終止密碼子喪失引起了開放閱讀框的改變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)長(zhǎng)度改變，原本156個(gè)氨基酸的肽鏈延長(zhǎng)至268個(gè)氨基酸，肽鏈延長(zhǎng)了71.8%，致病性未見報(bào)道。經(jīng)該家系驗(yàn)證分析，先證者及先證者之父為極重度感音神經(jīng)性聾且該位點(diǎn)純合變異；先證者之母聽力正常該位點(diǎn)雜合變異。根據(jù)ACMG指南判定該位點(diǎn)為致病性變異。推測(cè)此變異引起的開放閱讀框的改變影響了TMIE蛋白的羧基端與PCDH15的互作，造成機(jī)械能與電能轉(zhuǎn)導(dǎo)異常引起耳聾，具體此變異導(dǎo)致耳聾的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。該變異的檢出將有助于TMIE蛋白的功能分析和耳聾的基因診斷。

除了本研究的變異之外，目前TMIE基因共明確11種致病變異，包含7種錯(cuò)義變異、2種移碼變異、2種剪切位置變異。其中移碼變異均造成了截短蛋白，這與本研究中的延伸蛋白是不同的。已知報(bào)道的TMIE基因變異主要被發(fā)現(xiàn)在土耳其[8,9]，巴基斯坦[10]、印度[3,11]、約旦[10]等南亞和中東地區(qū)的遺傳性聾患者中，2009年劉玉和教授進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)在漢族人群中檢測(cè)了123例散發(fā)非綜合征型聾患者、62例遺傳性非綜合征型聾家系先證者、以及健康對(duì)照60例，并未發(fā)現(xiàn)TMIE基因致病變異[12]。臺(tái)灣地區(qū)檢測(cè)了250例患者人中一人攜帶了致病變異[13]。本研究是首次在中國(guó)人群中篩查到TMIE基因c.458_462delAAGGA純合變異，并首次明確了此變異為致病性變異。在53例散發(fā)耳聾患者中未檢測(cè)到TMIE變異，100例正常人群檢測(cè)此位點(diǎn)為陰性，這說(shuō)明TMIE基因變異具有一定的地域性，并不是我國(guó)耳聾患者的高發(fā)致病基因。本項(xiàng)目的發(fā)現(xiàn)在豐富TMIE基因致病變異譜的基礎(chǔ)上，也更加印證，中國(guó)耳聾患者致病基因的異質(zhì)性，有更多的工作值得我們進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，本研究通過(guò)靶向二代測(cè)序和Sanger測(cè)序相結(jié)合的方法，為一近親婚配的表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳性聾家系明確了致病基因，探討了耳聾芯片在臨床上應(yīng)用的方法，對(duì)于突變基因的篩選、確定及臨床遺傳咨詢提供了方法和依據(jù)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)和檢測(cè)成本的降低，該技術(shù)將在致病基因鑒定和遺傳變異檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。