（開封市中心醫(yī)院 心胸外科，河南 開封 475000）

肺癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第2位，病死率居首位，對人類健康造成嚴重威脅，因此探尋早期診斷的特異性指標成為目前肺癌的研究熱點[1]。成纖維生長因子受體 1（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1）在乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達，且應(yīng)用于臨床鱗狀細胞癌的篩查，在肺癌靶向治療中具有廣闊前景，但具體作用機制尚未完全闡明[2-4]。本研究探討慢病毒介導FGFR1沉默對肺癌細胞增殖、凋亡的影響，以期為肺癌靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系

肺癌細胞A549、H3255、A-427購自美國典型菌種保藏中心（ATCC），腎上皮細胞293T購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒載體pLVTHM購自武漢淼靈生物科技有限公司，MTT試劑盒購自上海嶸崴達實業(yè)有限公司，Trizol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit購自大連寶生生物工程有限公司，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司，BCA檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)BS、DMEM購自美國Gibco公司，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購自中國賽默飛世爾科技有限公司（上海），F(xiàn)GFR1單克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司，β-actin單克隆抗體購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，IRDye 680RD Donkey Anti-mouse IgG購自美國LI-COR公司，F(xiàn)ACScan流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 篩選高表達 FGFR1 mRNA 的肺癌細胞

采用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、H3255、A-427肺癌細胞。用Trizol法分別提取細胞總RNA，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書將提取的總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用德國 Mastercycler?ep realplex 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀檢測 FGFR1 mRNA 的相對表達量。每個反應(yīng)體系25μl，包括總cDNA 2μl，正反向引物各 1μl，SYBR 12.5μl，無 RNA 酶水補足反應(yīng)體系至25μl。反應(yīng)程序采用兩步法，退火溫度設(shè)置為60℃。所有實驗重復(fù)≥2次，每次設(shè)3個生物學重復(fù)。以A549做均一化處理，用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，篩選出FGFR1 mRNA表達較高的肺癌細胞。FGFR1和內(nèi)參基因GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物列表

1.4 慢病毒表達載體 LV-shFGFR1 的構(gòu)建、包裝及病毒顆粒的制備

FGFR1特異性siRNA引物：5’-CGCAAGTAACGT ACCGTAATA-3’，位于FGFR1基因 96～116 bp處，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。限制性內(nèi)切酶MluⅠ、ClaⅠ雙酶切pLVTHM，將目的片段經(jīng)DNA連接酶插入到酶切過的慢病毒表達載體，將構(gòu)建好的慢病毒表達載體（LV-shFGFR1）轉(zhuǎn)化至TOP10，篩選陽性克隆。將LV-shFGFR1、空載體分別與輔助包裝質(zhì)粒（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝干擾病毒顆粒，收毒，滴定至5×109TU/ml。

1.5 實驗分組

收集病毒上清，加至A549細胞中，感染復(fù)數(shù)為10，同時加入病毒感染增強液和聚凝胺（5μg/ml），感染shFGFR1病毒作為干擾組，感染空載體病毒作為空載體組，未進行感染的作為對照組。96 h后用熒光顯微鏡檢測重組慢病毒感染情況。

1.6 細胞檢測

1.6.1 qRT-PCR檢測 FGFR1 mRNA 提取各組細胞的總 RNA，參照 PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄總 RNA 為 cDNA，用 Mastercycler?ep realplex qRT-PCR儀檢測FGFR1 mRNA相對表達量。每個反應(yīng)體系20μl，包括總cDNA 2μl，正反向引物各1μl，SYBR 10μl，無 RNA 酶水 6μl。反應(yīng)程序采用兩步法，退火溫度設(shè)置為60℃。所有實驗重復(fù)≥2次，每次設(shè)3個生物學重復(fù)。以對照組做均一化處理，用2-ΔΔCt法計算 mRNA相對表達量。

1.6.2 Westernblotting 檢測 FGFR1 蛋白 采用細胞裂解液（含PMSF）裂解各組細胞，8 000 r/min離心15 min，收集上清，放置4℃條件下備用。利用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，具體實驗步驟參考說明書。根據(jù)檢測的蛋白濃度進行半定量，10% SDSPAGE分離蛋白，采用全濕法350 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂乳室溫封閉2 h，PBS緩沖液洗滌5次，3 min/次。一抗即FGFR1單克隆抗體（1∶1 000稀釋）或β-actin單克隆抗體（1∶1 000稀釋）室溫孵育 2.5 h，PBST 洗膜 3次，PBS洗膜 2次，5 min/次。室溫條件下避光，熒光二抗（IRDye 680RD Donkey Anti-mouse IgG,1 ∶ 20 000 稀釋）孵育 1.5 h，PBST洗膜3次，PBS洗膜2次，高壓ddH2O洗滌2次，3 min/次。采用Odyssey?紅外成像系統(tǒng)分析蛋白相對表達量。

1.6.3 MTT比色法檢測細胞增殖 使用 MTT 測定各組細胞的增殖活力。將細胞按1.0×105個/孔接種至96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后將其分為對照組、空載體組及感染組。對各組細胞采用不同方式處理后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于干擾0、12、24、48和72 h后，加入20μl/孔MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上層溶液，加入1 300μl/孔DMSO，振蕩溶解12 min。采用酶標儀測定470 nm處光密度（optical density,OD）值。

1.6.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將細胞按 1.0×105個/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，對各組細胞采用不同方式處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，適量PBS緩沖液洗滌3次，75%預(yù)冷乙醇保存，4℃過夜。PBS洗滌 3次，37℃條件下 20μl RNA 酶孵育細胞 20 min，避光條件下20μl碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色，4℃孵育30 min。采用FACScan流式細胞儀對細胞進行分析，利用ModFit LT細胞周期分析軟件對凋亡細胞進行統(tǒng)計。

1.6.5 Hoechest染色檢測細胞凋亡將細胞按1.0×105個/孔接種于含有飛片的24孔板中，培養(yǎng)48 h，棄上清，PBS緩慢洗滌 3次，每孔加入 2 ml 4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min，棄固定液，PBS緩慢洗滌3次，6 min/次，超凈臺中風干。避光條件下于飛片中央滴加 200μl Hoechest 33258 工作液，室溫染色20 min，PBS輕柔洗去染色液，洗滌3次，6 min/次，用鑷子小心取出飛片，濾紙小心吸去飛片多余液體，自然風干飛片，于干凈載玻片上滴加抗熒光猝滅劑1滴，于飛片細胞一側(cè)小心放置于滴加有抗熒光猝滅劑的位置上進行封片，封片后利用熒光顯微鏡進行觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A549 細胞中 FGFR1 mRNA 呈高表達

A549、H3255、A-427細 胞 中 FGFR1 mRNA 的相對表達量分別為（1.11±0.06）、（0.62±0.04）和（0.71±0.02），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=109.339，P=0.000）；A549細胞高于H3255和A-427細胞（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 種肺癌細胞中 FGFR1 mRNA 相對表達量比較（±s）

2.2 慢病毒穩(wěn)定感染 A549 細胞

感染96 h后，熒光顯微鏡檢測病毒感染A549細胞情況顯示，空載體組和干擾組細胞綠色熒光蛋白陽性率均＞90%，表明重組慢病毒對A549細胞有較好的親嗜性。見圖2。

圖2 A549 細胞病毒感染情況（×100）

2.3 干 擾組A549 細胞 中 FGFR1 mRNA 表達下調(diào)

以β-actin為內(nèi)參基因，對照組、空載體組、干擾組A549細胞中FGFR1 mRNA相對表達量分別為（1.09±0.12）、（1.07±0.10）和（0.21±0.03），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=89.787，P=0.000）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干擾組低于對照組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 干擾組細胞中 FGFR1 蛋白表達下降

圖3 各組FGFR1 mRNA 相對表達量比較（±s）

以GAPDH作為內(nèi)參，對照組、空載體組、干擾組A549細胞中FGFR1蛋白相對表達量分別為（0.42±0.09）、（0.39±0.07） 和（0.08±0.01）， 經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=24.344，P=0.001）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干擾組低于對照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組FGFR1 蛋白相對表達量比較（±s）

2.5 各組細胞增殖情況

干擾組、空載體組、對照組0、12、24、48和72 h的細胞增殖情況比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=75.321，P=0.000）；②3組細胞增殖情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=68.364，P=0.000）；③ 3組細胞增殖情況隨時間變化趨勢有差異（F=91.637，P=0.000）。見表2和圖5。

表2 各組細胞不同時間點的OD值比較

圖5 各組細胞 OD 值變化趨勢（±s）

2.6 干擾組細胞凋亡率上升

經(jīng)Hoechest染色顯示，對照組細胞凋亡率為（17.2±1.32）%，空載體組為（17.3±1.24）%，干擾組為（25.32±2.14）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=66.296，P=0.000）；空載體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干擾組高于對照組和空載體組（P＜0.05）。Hoechest染色檢測細胞凋亡結(jié)果與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致。見圖6～8。

圖6 流式細胞凋亡圖

圖7 各組細胞凋亡情況（Hoechest染色×400）

圖8 各組細胞凋亡率比較（±s）

3 討論

肺癌是目前世界范圍內(nèi)病死率最高的疾病[5]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌所占比例較大[6]。小細胞肺癌具有發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移較快和侵襲力強等特點，小細胞肺癌初治時較易獲得良好的療效，但后期治療極易對藥物產(chǎn)生耐藥性，出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]。非小細胞肺癌具有癌細胞增長緩慢，且轉(zhuǎn)移、擴散較晚等特點[8]。通常非小細胞肺癌患者不易被察覺，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)時已處于中、晚期，也因此導致非小細胞肺癌患者病死率居高不下[9]。肺癌受許多因素調(diào)控，機制極其復(fù)雜，其中包括一些基因結(jié)構(gòu)及表達發(fā)生變化等[10-13]。

FGFR1基因編碼的蛋白為酪氨酸激酶受體，是一個跨膜蛋白，成纖維生長因子受體可與FGFR1蛋白細胞外區(qū)域結(jié)合，導致FGFR1蛋白結(jié)構(gòu)改變和細胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生磷酸化，從而活化STAT、Rap1、MAPK和PI3K-Akt等信號通路[14]。隨著對FGFR1研究的不斷深入，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也越來越不容忽視。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中FGFR1相對表達量顯著高于癌旁正常組織，由此說明FGFR1為癌癥相關(guān)基因[15]。由于常用的放化療在肺癌治療上有生存率低和預(yù)后效果不理想等缺點，人們迫切需要一種新的治療方法來彌補放化療的不足，因此分子靶向治療走進了人們的視線，并隨著研究的不斷深入，目前分子靶向治療藥物已進入臨床應(yīng)用，例如以EGFR為靶點的易瑞沙和特羅凱便屬于該類藥物[16-17]。本研究利用肺癌細胞系，闡明慢病毒介導FGFR1沉默對肺癌細胞增殖和凋亡的影響，為肺癌分子靶向治療的研究提供實驗基礎(chǔ)。

本實驗采用qRT-PCR檢測各組FGFR1 mRNA相對表達量，結(jié)果顯示，A549細胞中FGFR1 mRNA相對表達量高于H3255和A-427細胞，因此本研究通過慢病毒介導抑制FGFR1表達來探討FGFR1對A549肺癌細胞增殖和凋亡的影響。siRNA是一種短片段dsRNA，能夠利用慢病毒載體對siRNA進行介導，在核酸內(nèi)切酶作用下，降解同源互補的mRNA，從而導致目的基因無法變大，呈現(xiàn)抑制狀態(tài)[18]。本研究結(jié)果顯示，干擾組FGFR1 mRNA相對表達量較對照組下調(diào)，表明慢病毒表達質(zhì)粒能夠干擾FGFR1基因的轉(zhuǎn)錄。采用Western blotting檢測各組FGFR1蛋白相對表達量，結(jié)果顯示，干擾組FGFR1蛋白相對表達量較對照組下調(diào)，進一步驗證慢病毒表達質(zhì)粒能夠干擾FGFR1蛋白的表達。Western blotting檢測結(jié)果與實時熒光定量檢測結(jié)果一致，表明無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上，干擾組FGFR1 mRNA和蛋白相對表達量均表現(xiàn)為下調(diào)。過往研究表明，當FGFR1表達受到抑制時可有效抑制胃癌細胞增殖[19]。本研究通過MTT比色法發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾組中細胞增殖率下降，說明慢病毒介導的FGFR1基因沉默能夠抑制肺癌細胞的增殖，與過往相關(guān)研究一致[19]，表明在肺癌細胞中FGFR1相對表達量下調(diào)也能有效抑制癌細胞增殖。相關(guān)研究表明，在卵巢癌中FGFR1相對表達量下調(diào)可促進細胞凋亡，增加對藥物的敏感性[20]。本研究中FGFR1細胞凋亡結(jié)果顯示，干擾組細胞凋亡率高于對照組，表明慢病毒介導的FGFR1基因沉默能夠促進肺癌細胞的凋亡，與過往其他癌癥研究結(jié)果一致[20]。本研究通過對照組與空載體組的對比，可以排除慢病毒載體本身對FGFR1表達產(chǎn)生影響的干擾。

綜上所述，慢病毒介導的FGFR1沉默，顯著抑制FGFR1表達，從而抑制肺癌細胞增殖，同時促進肺癌細胞的凋亡。提示FGFR1可能參與肺癌細胞的發(fā)生、發(fā)展過程，同時也說明FGFR1有潛力成為新的藥物分子靶標，但還需對其進一步驗證，本研究結(jié)果為肺癌基因治療提供新的實驗基礎(chǔ)。