徐 陽(yáng)，李明宇，李加俊，鮑慧瑋

(1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)與食品學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130031；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

哈蟆油(Oviductus Ranae)系蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid.)雌蛙的輸卵管干制品[1]，純天然、無(wú)污染、全營(yíng)養(yǎng)，已然成為中國(guó)東北的珍貴滋補(bǔ)品[2-4]。哈蟆油的食用歷史可追溯到滿族入關(guān)之前，只有在滿族大祀或大宴等重要活動(dòng)時(shí)，哈蟆油才會(huì)作為最圣潔的食品出庖供盤。而在民間，哈蟆油有多種加工方法，比如蒸、燉、烘干等[5-7]，這些加工方法對(duì)哈蟆油中主要活性成分的影響尚不明確。因此，本文以2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中哈蟆油的鑒別指標(biāo)——1-甲基海因?yàn)檠芯繉?duì)象[8-11]，通過(guò)HPLC法建立含量測(cè)定方法，并對(duì)不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量進(jìn)行比較，為哈蟆油加工方法的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀、Chemstation工作站(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004B型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；AB135-S型電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

哈蟆油(吉林省鼎源特產(chǎn)經(jīng)貿(mào)有限公司，批號(hào)：20170801)，經(jīng)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室肖井雷副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定；1-甲基海因(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111836-201102)。

甲醇(色譜純，F(xiàn)isher有限公司)；磷酸(分析純，北京化工廠)；純凈水(杭州娃哈哈股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哈蟆油加工品的加工方法

不同哈蟆油加工品的加工方法見表1。

表1 不同哈蟆油加工品的加工方法

1.2.2 色譜條件

色譜柱為AlltimaTMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為純凈水，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 對(duì)照品溶液

取1-甲基海因?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含0.102 mg的溶液，作為1-甲基海因?qū)φ掌纺敢?；精密吸?-甲基海因?qū)φ掌纺敢? mL，置10 mL量瓶中，制成1mL含10.2 μg的溶液，即得。

1.2.3.2 供試品溶液

取清炒、焦炒、水煮、清蒸、烘干及未加工的哈蟆油適量，粉碎，稱取約5 g，加入8倍量甲醇超聲提取30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，過(guò)濾，同法提取3次，收集、合并濾液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、清炒哈蟆油供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1和圖2，待測(cè)色譜峰與相鄰色譜峰基本分離，理論塔板數(shù)按1-甲基海因峰計(jì)算均不低于3 000。

2.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取上述配制好的1-甲基海因?qū)φ掌纺敢?.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容到刻度，搖勻，使質(zhì)量濃度分別為2.04、4.08、10.20、20.40、40.80、102 μg/mL。將6種溶液分別注入高效液相色譜儀中，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，得回歸方程y=42.195x+0.087 3(R2=0.999 6)，結(jié)果表明，1-甲基海因質(zhì)量濃度在2.04～102 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

圖1 1-甲基海因?qū)φ掌飞V圖

圖2 清炒哈蟆油供試品色譜圖

圖3 1-甲基海因線性關(guān)系曲線

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取1-甲基海因?qū)φ掌啡芤?，按照譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到1-甲基海因色譜峰面積的RSD值為1.37%，表明該儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批清炒哈蟆油樣品(批號(hào)：190501)6份，制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到1-甲基海因含量的RSD值為1.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取清炒哈蟆油供試品溶液，置于室溫，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到1-甲基海因色譜峰面積的RSD值為1.66%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的清炒哈蟆油樣品6份，每份約2.56 g，每份均加入5 mL的1-甲基海因?qū)φ掌啡芤?6.67 μg/mL)，制備供試品溶液，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到1-甲基海因的平均回收率為99.76%，RSD值為1.45%(表2)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量測(cè)定

取5種不同的哈蟆油加工品及未加工品，制備供試品溶液，按照色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算1-甲基海因含量，結(jié)果見表3。

表2 1-甲基海因加樣回收率試驗(yàn)

表3 不同哈蟆油加工品中1-甲基海因的含量

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本文采用二極管陣列(DAD)檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到1-甲基海因在215 nm有較大的吸收峰，且與鄰近色譜峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，故選擇在該波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 流動(dòng)相體系的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本文預(yù)先選擇了甲醇、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸和水6種流動(dòng)相體系進(jìn)行比較[12-14]，考慮到待測(cè)色譜峰與相鄰色譜峰的分離情況及峰形效果，故選擇100%水作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

3.3 供試品制備方法的選擇

本文分別比較了不同提取方法(超聲提取法、回流提取法和浸漬法)、不同提取溶劑(甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、水)和不同提取時(shí)間(15 min、30 min、45 min、60 min)對(duì)哈蟆油加工品中1-甲基海因提取率的影響，發(fā)現(xiàn)采用甲醇超聲提取30 min時(shí)，1-甲基海因提取較完全，且不隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，故選擇此條件處理供試品。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

本文通過(guò)對(duì)哈蟆油5種不同加工品中相關(guān)活性成分1-甲基海因的含量進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)100℃烘干4 h與未加工哈蟆油樣品中1-甲基海因的含量差別較小，水煮和清蒸的加工方法使1-甲基海因的含量略有下降，清炒和炒焦的加工方法使1-甲基海因的含量明顯地下降，且隨著炒制時(shí)間的增加，1-甲基海因的含量隨之驟降，這些因素都可能影響哈蟆油的相關(guān)藥效作用。

4 結(jié)論

本文建立的HPLC測(cè)定不同哈蟆油加工品中1-甲基海因含量的方法操作簡(jiǎn)單、便捷、重復(fù)性良好?？紤]到哈蟆油不同的加工方法還會(huì)影響到微生物活性、水溶性蛋白含量等方面，因此仍需對(duì)加工方法進(jìn)行進(jìn)一步推敲，以確保達(dá)到哈蟆油藥效的最佳發(fā)揮。