甘小蓉，王 超，楊超慧

(1. 河海大學(xué) 淺水湖泊綜合治理與資源開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210098；2. 河海大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，南京 210098)

1 前 言

水華一直是當(dāng)代水環(huán)境污染問(wèn)題中比較重要且突出的一項(xiàng)，其中隸屬藍(lán)藻門的銅綠微囊藻是造成水華現(xiàn)象的罪魁禍?zhǔn)字?。銅綠微囊藻能夠產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的微囊藻毒素，藻毒素在水體中擴(kuò)散會(huì)影響自然水體生態(tài)功能，進(jìn)而危害人體健康和影響社會(huì)穩(wěn)定。

為了解決水體富營(yíng)養(yǎng)化這一問(wèn)題，上個(gè)世紀(jì)八十年代開(kāi)始到今天國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了大量的研究，得出的控藻抑藻的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法等[1～5]；除此之外，超聲波除藻技術(shù)也得到了相應(yīng)的研究與發(fā)展，但是其存在較大的安全隱患，可能會(huì)對(duì)周圍水生動(dòng)、植物造成不利的影響[6～8]。近年來(lái)，水生植物分泌的次生代謝物質(zhì)對(duì)藻類的化感抑制作用逐漸成為了領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。

大量的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室研究均表明水生植物可以分泌和釋放一些化學(xué)物質(zhì)對(duì)引起水華的藻類產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而控制藍(lán)藻水華的產(chǎn)生[9-10]。而化感物質(zhì)作為植物次生代謝物質(zhì)，自然環(huán)境下可降解，在生態(tài)系統(tǒng)中不易積累，生態(tài)安全性較好[11]。魯志營(yíng)等[12]研究化感抑藻的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)是通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、影響藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素合成從而破壞光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、影響藻細(xì)胞呼吸作用等進(jìn)行抑藻?，F(xiàn)有的研究報(bào)道中從有抑藻作用的植物中分離鑒定出的化感物質(zhì)有沒(méi)食子酸、豆蔻酸、壬酸、N-苯基-1-萘胺、N-苯基-2-萘胺和鄰苯二酚等[13～17]。李霞發(fā)現(xiàn)大部分酚酸物質(zhì)都具有化感作用[18]，而且其自氧化產(chǎn)物對(duì)銅綠微囊藻抑制作用顯著，其中鄰苯二酚和沒(méi)食子酸是兩種常見(jiàn)的酚酸類化感物質(zhì)[19]。劉光濤等[20]發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的水生植物鳳眼蓮根系分泌物壬酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果顯著。除水生植物以外，從陸生植物提取出的化感物質(zhì)也能破壞藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，倪利曉等[21]發(fā)現(xiàn)從黃花嵩莖葉中提取的青蒿素對(duì)銅綠微囊藻有良好的抑制效果，其作為抑藻劑的應(yīng)用已經(jīng)申請(qǐng)專利。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青蒿素、壬酸、鄰苯二酚單獨(dú)作用于銅綠微囊藻時(shí)EC50為23.66mg/L、18.81mg/L、5.50mg/L。丁惠君等[19]研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸對(duì)銅綠微囊藻的EC50為1.73mg/L。本研究以銅綠微囊藻為實(shí)驗(yàn)藻種，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了青蒿素、壬酸、沒(méi)食子酸和鄰苯二酚四種化學(xué)物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒獾囊种菩?yīng)的差異，以期為日后篩選和利用水生植物分泌的化感物質(zhì)來(lái)控制水華做出有益的探究。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

青蒿素(artemisinin，分析純)、壬酸(nonanoic acid，分析純)、沒(méi)食子酸(gallic acid，分析純)和鄰苯二酚(catechol，分析純)均購(gòu)置于上海阿拉丁試劑有限公司。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB-937)購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

采用BG-11無(wú)菌培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)所需銅綠微囊藻進(jìn)行擴(kuò)培，人工氣候箱溫度設(shè)置為(25±1)℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為2 000 lx，光暗比 12 h∶12 h，每天搖動(dòng)錐形瓶2～3次并適當(dāng)調(diào)換位置。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

將銅綠微囊藻擴(kuò)大培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，在含有250mL藻液的錐形瓶中加入相同質(zhì)量濃度(12.4mg/L)的青蒿素、壬酸、沒(méi)食子酸和鄰苯二酚，并設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)置三個(gè)平行。測(cè)定第0d、1d、2d、3d、4d、7d的OD680值以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理和分析。

2.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

2.3.1 OD680和藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

利用分光光度計(jì)測(cè)定銅綠微囊藻懸液在680nm處的OD值，根據(jù)提前繪制好的微囊藻生物量和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=8.796 3x+0.144 4, R2=0.998 5)計(jì)算細(xì)胞數(shù)[22]。

2.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

利用浮游植物熒光儀( PHYTO-PAM，Germany)測(cè)定銅綠微囊藻懸液中葉綠素a含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。相關(guān)參數(shù)含義如下：

Fv/Fm指PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，是對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)反應(yīng)可能達(dá)到的最大產(chǎn)量的評(píng)估，是研究外界環(huán)境脅迫等因素對(duì)光合作用影響的重要指標(biāo)[23]；

Alpha，初始斜率，反映了樣品對(duì)光能的利用效率[24]；

ETRmax，藻類最大光合速率，即最大相對(duì)電子傳遞速率[24]；

Ik，半飽和光照強(qiáng)度，反映了藻類對(duì)強(qiáng)光的耐受能力強(qiáng)弱[24]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用WPS和origin9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，測(cè)得的數(shù)據(jù)取均值。采用SPSS20.0對(duì)處理組和對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，設(shè)P<0.05兩組之間存在顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，同一抑制濃度(12.4mg/L)下，鄰苯二酚處理組對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有顯著影響(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)第10d鄰苯二酚的抑制率為83.49%；青蒿素和壬酸處理組隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)也表現(xiàn)出了對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，培養(yǎng)第10d青蒿素和壬酸的抑制率分別為24.50%和18.80%；沒(méi)食子酸處理組實(shí)現(xiàn)初期表現(xiàn)出了對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，實(shí)驗(yàn)第2d、第3d和第4d的抑制率分別為28.61%、28.34%和26.89%，實(shí)驗(yàn)后期效果不明顯。酚酸類物質(zhì)容易氧化，自氧化產(chǎn)物對(duì)銅綠微囊藻抑制作用比較明顯[25]；有研究表明，沒(méi)食子酸在堿性、中性、強(qiáng)氧化條件下不穩(wěn)定[26]，沒(méi)食子酸后期表現(xiàn)不佳，沒(méi)有達(dá)到同類物質(zhì)鄰苯二酚的抑藻效果，很有可能是本實(shí)驗(yàn)環(huán)境導(dǎo)致的；丁惠君等[19]則認(rèn)為高濃度的沒(méi)食子酸使得藻液呈弱酸性( pH為6～7) ，不易發(fā)生自氧化反應(yīng)，這也可能導(dǎo)致沒(méi)食子酸抑藻效果不如鄰苯二酚；具體原因還有待進(jìn)一步研究。

圖1 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)影響Fig.1 Effects of four allelopathic substances on the growth of Microcystis aeruginosa

3.2 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a主要位于光合系統(tǒng)Ⅱ的核心復(fù)合體上，能吸收能量傳遞到反應(yīng)中心進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)[27]。當(dāng)藻細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時(shí)，其生理過(guò)程會(huì)受到影響，直接或間接地影響到葉綠素a含量，因此葉綠素 a 含量變化可以看成是藻類受到脅迫的生理反應(yīng)指標(biāo)[28]。由圖2可知，鄰苯二酚處理組對(duì)銅綠微囊藻的葉綠素a含量有顯著影響(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)第10d鄰苯二酚處理組葉綠素a含量?jī)H為對(duì)照組的10.30%，這一結(jié)果與圖1所述的生長(zhǎng)量抑制結(jié)果相符，銅綠微囊藻的生物量減少會(huì)直接造成葉綠素a含量下降；沒(méi)食子酸處理組在實(shí)驗(yàn)初期葉綠素a含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)第1d、第2d和第3d的葉綠素a 含量分別占對(duì)照組的70.64%、68.91%和59.45%；青蒿素和壬酸處理組隨著時(shí)間的推移對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響逐漸增大，實(shí)驗(yàn)第10d兩組的葉綠素a含量分別占對(duì)照組的75.99%和84.31%。

3.3 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻Fv/Fm的影響

Fv/ Fm是光合系統(tǒng)Ⅱ在暗適應(yīng)后的最大量子產(chǎn)量[29]，代表植物和藻類潛在光合能力，數(shù)值變化能夠反映PSⅡ的受外界脅迫后的功能狀態(tài)變化。

圖2 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響Fig.2 Effects of four allelopathic substances on chlorophyll a content in Microcystis aeruginosa

由圖3可知，除鄰苯二酚處理組外，其他4組包括對(duì)照組的Fv/Fm值維持在0.25～0.40之間；實(shí)驗(yàn)第一天時(shí)，除青蒿素處理組外，其他3個(gè)處理組較對(duì)照組而言，F(xiàn)v/Fm值都下降了，其中壬酸組下降了12.18%，沒(méi)食子酸組下降了17.00%，鄰苯二酚處理組下降了95.18%，這說(shuō)明壬酸、沒(méi)食子酸、鄰苯二酚抑制了銅綠微囊藻的光合活性，削弱了藻類的潛在光合能力；其中鄰苯二酚處理組Fv/Fm值已經(jīng)接近0，實(shí)驗(yàn)后期也維持了顯著的抑制效果，這說(shuō)明鄰苯二酚從根本上破壞了銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，因此脅迫效應(yīng)顯著；沒(méi)食子酸處理組、青蒿素處理組和壬酸處理組后期數(shù)值高于對(duì)照組，則說(shuō)明沒(méi)食子酸、青蒿素和壬酸只是短期內(nèi)抑制了銅綠微囊藻PSⅡ的光合活性，后期藻細(xì)胞光合功能得以恢復(fù)甚至增強(qiáng)。

圖3 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻Fv/Fm的影響Fig.3 Effects of four allelopathic substances on Fv/Fm of Microcystis aeruginosa

3.4 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻α的影響

圖4 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻α的影響Fig.4 Effects of four allelopathic compounds on α of Microcystella aeruginosa

由圖4可知，除鄰苯二酚處理組外，其他四組包括對(duì)照組的銅綠微囊藻α值維持在0.11～0.18之間；實(shí)驗(yàn)第一天時(shí)，除壬酸處理組外，其他3個(gè)處理組和對(duì)照組α值都下降了；隨著時(shí)間的推移，壬酸處理組的α值在第三天開(kāi)始下降；鄰苯二酚處理組α值在實(shí)驗(yàn)第一天的時(shí)候已經(jīng)接近0，實(shí)驗(yàn)后期也維持了顯著的抑制效果，進(jìn)一步說(shuō)明鄰苯二酚從根本上破壞了銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)；對(duì)照組的α值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，很有可能是銅綠微囊藻大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致對(duì)光和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)加劇，因此削弱了藻細(xì)胞對(duì)光能的利用效率；而其他四個(gè)處理組，除了從根本上破壞了藻細(xì)胞PSⅡ的鄰苯二酚處理組，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)，青蒿素組、壬酸組和沒(méi)食子酸組的α值分別高于對(duì)照組24.07%、30.56%和71.29%。

3.5 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻ETRmax的影響

ETRmax反映了藻類的潛在最大光合速率，是光合活性的重要指標(biāo)，可以指示藻類的“生長(zhǎng)潛能”[30]。由圖5可知，除沒(méi)食子酸處理組外，其他四組的電子傳遞速率總體都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；鄰苯二酚處理組ETRmax值在實(shí)驗(yàn)第一天的時(shí)候已經(jīng)接近0，實(shí)驗(yàn)后期也維持了顯著的抑制效果；青蒿素處理組的ETRmax值隨著時(shí)間的推移越來(lái)越小，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)接近為0；這說(shuō)明鄰苯二酚和青蒿素對(duì)銅綠微囊藻的光合活性抑制作用是持續(xù)的，藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)Ⅱ可能遭受到了不可恢復(fù)的破壞；壬酸處理組的ETRmax值與對(duì)照組的相近，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)略低于對(duì)照組；沒(méi)食子酸處理組ETRmax值表現(xiàn)出了先增加后減小的趨勢(shì)，但是始終高于其他三個(gè)處理組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)顯著高于對(duì)照組，Ihnken 等[31]發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的非光化學(xué)猝滅( NPQ) 活性能影響光合作用電子傳遞速率，沒(méi)食子酸處理組的銅綠微囊藻細(xì)胞ETRmax顯著高于其他四組，這可能與藻細(xì)胞的NPQ有關(guān)。

圖5 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻ETRmax的影響Fig.5 Effects of four allelopathic substances on ETRmax of Microcystis aeruginosa

3.6 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻Ik的影響

Ik值可以反映藻類對(duì)強(qiáng)光的耐受能力。由圖6可知，鄰苯二酚處理組Ik值在實(shí)驗(yàn)第一天的時(shí)候已經(jīng)接近0，實(shí)驗(yàn)后期也維持了顯著的抑制效果；青蒿素處理組的Ik值隨著時(shí)間的推移越來(lái)越小，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)接近為0，與該處理組的ETRmax值變化規(guī)律相似，這進(jìn)一步說(shuō)明青蒿素對(duì)銅綠微囊藻的光合活性抑制作用是持續(xù)的；壬酸處理組的Ik值與對(duì)照組的相近，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)略低于對(duì)照組，這也和該處理組的ETRmax值變化規(guī)律相似，說(shuō)明藻類潛在光合速率減小伴隨而來(lái)的是對(duì)強(qiáng)光的耐受能力減弱；沒(méi)食子酸處理組Ik值表現(xiàn)出了先增加后減小的趨勢(shì)，但是始終高于其他3個(gè)處理組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)第10d時(shí)高于對(duì)照組41.73%，這說(shuō)明沒(méi)食子酸增強(qiáng)了銅綠微囊藻對(duì)強(qiáng)光的耐受能力。

圖6 4種化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻Ik的影響Fig.6 Effects of four allelopathic substances on Ik of microcystis aeruginosa

4 結(jié) 論

4.1 在本文試驗(yàn)條件下，4種化感物質(zhì)中鄰苯二酚對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果最好，青蒿素次之。

4.2 鄰苯二酚、青蒿素和壬酸都通過(guò)降低銅綠微囊藻的葉綠素 a 含量、光合速率、對(duì)強(qiáng)光的耐受能力而抑制其生長(zhǎng)。

4.3 鄰苯二酚和青蒿素對(duì)銅綠微囊藻PSⅡ的光合活性破壞是持續(xù)的，不可恢復(fù)的。