劉淳 林順歡 賈筠 關(guān)靈 鄭銳年 林欽雄 劉克軍袁惠玲 葉偉標(biāo) 廖玉婷

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2臨床研究中心，3乳腺科，4病理科（廣東東莞523000）

乳腺癌占女性所有腫瘤的29%，是中國和世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤［1］。雖然近年來對于乳腺癌的診斷和治療方法取得了很大進(jìn)展，但乳腺癌患者的5年生存率仍然較低，由于乳腺癌轉(zhuǎn)移率高，且目前其發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全清楚［2］，因此，深入探討乳腺癌的分子機(jī)制對乳腺癌的診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是長度超過200 nt 的RNA，其參與腫瘤的多種生物學(xué)行為［3］。既往研究表明，LncRNA-NORAD 可被YAP 途徑抑制并通過隔離S100P 抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［4］。而LncRNA-sONE 可通過誘導(dǎo)miR-34a、miR-15a、miR-16 和let-7a 的表達(dá)來抑制三陰性乳腺癌侵襲性［5］。研究表明，LncRNA 小核仁RNA 宿主基因14（small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14）一種關(guān)鍵的LncRNA，LncRNA-SNHG14 在多種腫瘤中差異表達(dá)，通過海綿狀miR-203 促進(jìn)細(xì)胞腎細(xì)胞癌遷移和侵襲［6］。且LncRNA-SNHG14 可通過吸附miR-92a-3p 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。也有研究顯示LncRNA-SNHG14 通過吸附miR-340 從而在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮致癌功能［8］。因此，LncRNA-SNHG14 在不同腫瘤中具有差異的生物學(xué)功能，目前對于LncRNA-SNHG14 在乳腺癌中的表達(dá)和對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響仍未明確。本研究旨在探討LncRNA-SNHG14 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平，及其對乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響和潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 組織收集收集于2018年1月至2019年1月在我院行手術(shù)治療的乳腺癌組織和癌旁組織共40例，其中腫瘤分期Ⅰ期12 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4 例，組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)16 例、Ⅱ級(jí)14 例、Ⅲ級(jí)10 例。所有患者在術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。所有組織用無菌PSB 洗滌后，快速放入冷凍液氮，儲(chǔ)存在-80 ℃待測。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理CAL51、BT474、HCC1954、HS578T、T-47D 人乳腺癌細(xì)胞，以及正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A 購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)基由10%胎牛血清（FBS；Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA），Dulbecco改良的Eagle 培 養(yǎng)基（DMEM）（Gibco、Rockville，MD，USA）組成。細(xì)胞置于含有5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成了針對LncRNA-SNHG14 的表達(dá)短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒，具體靶向序列為5′-GCAACATTCCCTGAACATACT-3′（shRNA#1）和5′-GCGAGGAATCTGATTCCAAGC-3′（shRNA#2）的shRNA 連接到pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA載體，并通過包裝病毒質(zhì)粒包裝成慢病毒，具體操作由和園生物技術(shù)公司（上海）進(jìn)行。然后將LncRNA-SNHG14 的shRNA 和空載對照（對照）的慢病毒用于CAL51 乳腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，并采用嘌呤霉素（5 μg∕mL）篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株14 d 后，使用RT-qPCR 檢測細(xì)胞中LncRNA-SNHG14 的表達(dá)水平。

1.4 RNA 提取和RT-qPCR用TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離組織和細(xì)胞中的總RNA。使用TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China），然 后從總RNA 逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)的脫氧核糖核酸（cDNA）。RTqPCR 條件如下：在95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，總共35 個(gè)循環(huán)。RT-qPCR 引物：SNHG14，正向：5′-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3′，反向：5′-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3′，β-actin，正向：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′和反向：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。用ABI 7500 進(jìn)行qRT-PCR 測定（Invitrogen），has-miR-144，正向：5′-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3′，反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，通過2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNASNHG14 在乳腺癌組織中或細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞增殖檢測通過CCK-8 法測定（Dojindo，Kumamoto，Japan）每24 小時(shí)監(jiān)測96 孔板中乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖水平。CCK-8 試劑孵育60 min 后，采用分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）測量450 nm 處的吸光度。并通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖水平，具體將處于對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞約500 個(gè)接種到6 孔板，培養(yǎng)20 d 后，固定后采用結(jié)晶紫染色于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：8 μm 孔徑的Transwell 小室（Corning，NY，USA）進(jìn)行。 將150 μL 無血清DMEM 中的4×104個(gè)細(xì)胞鋪到含有50 μg 基質(zhì)膠（BD，Bedford，MA，USA）的Transwell 小室的上室中。下室加入600 μL 的10%FBS+DMEM。48 h 后，將室的頂部表面用預(yù)冷的甲醇浸沒10 min，并用結(jié)晶紫染色30 min，統(tǒng)計(jì)遷移入下室的乳腺癌細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則不采用基質(zhì)膠讓腫瘤細(xì)胞遷移8 h。

1.7 結(jié)合位點(diǎn)和預(yù)后分析采用starBase V3.0（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預(yù) 測SNHG14 結(jié) 合 的miRNA，并通過Kaplan Meier plotter（http：∕∕kmplot.com∕analysis∕）工 具 分析miRNA 與 乳 腺 癌預(yù) 后的關(guān)系。

1.8 熒光素酶測定將SNHG14 的3′-UTR 克隆到pGL3 載體（Promega，Madison，WI，USA）中作為野生型（WT）3′-UTR。通過快速變化的定點(diǎn)誘變試劑盒（Stratagene，La Jolla，CA，USA）進(jìn)行SNHG14 3′-UTR 中作為has-miR-144 結(jié)合位點(diǎn)的進(jìn)行突變（MUT）。然后，它們用于轉(zhuǎn)染CAL51 細(xì)胞。采用熒光素酶測定在雙熒光素酶的表達(dá)。

1.9 Western Blot 檢測采用RIPA 裂解細(xì)胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，在SDS-PAGE 凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，4 ℃孵育一抗過夜，Rabbit Anti-CEP55抗體（ab170414）和Anti-beta Actin（ab227387）抗體均購自abcam。采用HRP 標(biāo)記二抗孵育1 h后，采用ECL 法進(jìn)行顯影，圖像采集后采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK 法檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和細(xì)胞系中LncRNA-SNHG14 的表達(dá)水平分析40 例乳腺癌腫瘤組織和癌旁組織對比中，其中腫瘤組織的LncRNA-SNHG14 的表達(dá)水平平均為（3.62±0.74）倍數(shù)變化，顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）；而CAL51、BT474、HCC1954、HS578T、T-47D 人乳腺癌細(xì)胞系的LncRNA-SNHG14 的表達(dá)水平均顯著高于正常的乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A，其中CAL51的表達(dá)水平最高，為（9.22 ± 0.45）倍數(shù)變化（圖1B）。腫瘤分期為Ⅲ、Ⅳ期的LncRNA-SNHG14 的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期，且腫瘤組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的LncRNA-SNHG14的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、1D）。

2.2 敲低LncRNA-SNHG14 表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響采用慢病毒敲低CAL51 細(xì)胞系的LncRNA-SNHG14表達(dá)后，RT-qPCR結(jié)果顯示shRNA#1的敲低效率最高（圖2A）。CCK-8 檢測結(jié)果顯示敲低LncRNA-SNHG14 表達(dá)后24、48 和72 h，CAL51細(xì)胞的活性顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示shRNA#1 的CAL51 細(xì)胞系其克隆形成數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05，圖2C、2D）。

圖1 乳腺癌組織和細(xì)胞系的LncRNA-SNHG14 表達(dá)水平Fig.1 LncRNA-SNHG14 expression levels in breast cancer tissues and cell lines

2.3 LncRNA-SNHG14 對乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響敲低LncRNA-SNHG14 后，CAL51 細(xì)胞的侵襲和遷移到下室的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.001，圖3），表明敲低LncRNA-SNHG14 后乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力均顯著下降。

圖2 LncRNA-SNHG14 表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of LncRNA-SNHG14 expression on proliferation of breast cancer cells

圖3 LncRNA-SNHG14 對乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用Fig.3 Effect of LncRNA-SNHG14 on invasion and migration of breast cancer cells

2.4 LncRNA-SNHG14 在乳腺癌細(xì)胞中與hasmiR-144 的關(guān)系采用starBase V3.0 預(yù)測到LncRNA-SNHG14 可以與miR-144 相結(jié)合，且has-miR-144 能靶向降解中心體蛋白55（centrosomal protein 55，CEP55）（圖4A），敲低LncRNA-SNHG14后CAL51的miR-144的表達(dá)量顯著上調(diào)（圖4B），且熒光素酶和RNP 檢測試驗(yàn)明確了LncRNA-SNHG14 可以與miR-144 相結(jié)合（圖4C）。Kaplan Meier plotter 結(jié)果顯示miR-144低表達(dá)乳腺癌患者總體生存率顯著下降（圖4D）。敲低LncRNA-SNHG14 后CAL51 細(xì)胞CEP55的表達(dá)水平顯著下降（圖4E、4F）。

圖4 LncRNA-SNHG14 與miR-144 和CEP55 的關(guān)系Fig.4 Relationship between LncRNA-SNHG14 and miR-144 and CEP55

3 討論

大量研究表明LncRNAs 是乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子。LncRNA SNAR 可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可能是新的治療靶點(diǎn)［9］。LncRNA UCA1 在乳腺癌中起著致癌基因的作用，通過靶向miR-143 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡［10］。LncRNA LINP1 可促進(jìn)DNA 雙鏈斷裂的修復(fù)，并提高乳腺癌細(xì)胞對放療的敏感性［11］。因此，探討LncRNAs 在乳腺癌中的作用對乳腺癌的病理生理機(jī)制提供了新的機(jī)遇和治療方向。最近研究［12］表明LncRNA-SNHG14在腫瘤發(fā)生的進(jìn)展中起重要作用。本研究的結(jié)果初步明確了LncRNA-SNHG14在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。此外，沉默LncRNA-SNHG14 后顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步明確了LncRNA-SNHG14可以吸附miR-144 從而調(diào)節(jié)CEP55 的表達(dá)以發(fā)揮其作用。表明LncRNA-SNHG14 是調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的重要因子。

本研究首先明確了SNHG14 在乳腺癌組織和細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，并且抑制SNHG14 可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移作用。表明SNHG14 可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。既往研究［13］顯示LncSNHG14 促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展，SNHG14 的過表達(dá)加速了增殖潛能和細(xì)胞周期進(jìn)程。且SNHG14 在宮頸癌中可以顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］，這表明了SNHG14 在多種腫瘤中均有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。

探討SNHG14 在乳腺癌中促進(jìn)其增殖和轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制，筆者首先發(fā)現(xiàn)了SNHG14 可以吸附miR-144，從而間接調(diào)節(jié)了CEP55 的表達(dá)。CEP55作為微管-成束蛋白，其可在間期細(xì)胞的中心體中發(fā)現(xiàn)，并在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用［15］。既往研究［16］表明CEP55 可以促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)生變化，是細(xì)胞周期的生物標(biāo)志物，且CEP55 在乳腺癌中顯著高表達(dá)。同時(shí)，miR-144 可以同靶向CEP55 而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，具體是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和通過抑制CEP55 的表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞凋亡。本研究中采用Kaplan Meier plotter 預(yù)測到了miR-144 低表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后顯著不良，而敲低SNHG14 后乳腺癌細(xì)胞miR-144的表達(dá)顯著升高，而CEP55 的表達(dá)水平顯著下降，表明了SNHG14 是通過靶向吸附miR-144，進(jìn)一步介導(dǎo)CEP55 表達(dá)上升的信號(hào)軸發(fā)揮了對乳腺癌增殖和遷移的促進(jìn)作用。

對于SNHG14 對乳腺癌的體內(nèi)作用以及其調(diào)節(jié)miR-144 的具體機(jī)制，仍需要進(jìn)一步深入研究。綜上所述，LncRNA-SNHG14 在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，LncRNA-SNHG14 可通過miR-144∕CEP55 信號(hào)軸從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。LncRNA-SNHG14 有望成為治療乳腺癌的重要靶點(diǎn)。