王曉榮 烏云高娃 趙福全 高玉峰

內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院1蒙醫(yī)腦血管介入科，2蒙西醫(yī)腎病科（內(nèi)蒙古通遼028000）

缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有較高的死亡率和致殘率，嚴(yán)重威脅人類的健康和生存質(zhì)量［1］。其病理生理過(guò)程非常復(fù)雜，可在多種因素條件下引起腦部血液流動(dòng)障礙，導(dǎo)致大腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，會(huì)出現(xiàn)動(dòng)作、語(yǔ)言、感覺(jué)和記憶能力等神經(jīng)功能障礙［2］。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B（PI3K∕Akt）信號(hào)通路對(duì)相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，PI3K∕Akt 可將膜受體信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，來(lái)實(shí)現(xiàn)維持細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程［3］。作為Akt 的底物，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件［4］。丁基苯酞（butyl phthalide，NBP）是對(duì)缺血性腦梗死患者神經(jīng)功能改善具有顯著效果的藥物，可防止因腦缺血造成腦梗死的發(fā)生，同時(shí)有研究［5］表明，NBP 還能改善缺血部位的能量代謝，參與抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。NBP 通過(guò)對(duì)PI3K∕Akt∕GSK-3β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)保護(hù)局部腦缺血損傷腦梗死的作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈局灶缺血模型，探討NBP 對(duì)局部腦缺血損傷腦梗死的保護(hù)作用，同時(shí)分析其對(duì)PI3K∕Akt∕GSK-3β信號(hào)通路的調(diào)控作用，從而為臨床提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑12 ～15 周齡的SPF 級(jí)健康Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量200 ～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；NBP 購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；LY294002 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；尼龍線購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）化學(xué)發(fā)光試劑盒、Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β抗體均購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)PALL 公司；磁共振掃描儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；BXM-950 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；CM1850石蠟切片機(jī)購(gòu)自北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司；蛋白印跡設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio Rad 公司。

1.2 模型構(gòu)建和分組處理將100 只12 ～15 周齡的SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠隨機(jī)分為5 組（n= 20）：假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（Model 組）、NBP 組、P13K 特異性抑制劑LY294002 組（LY 組）和NBP+LY組。模型構(gòu)建：大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線，參照參考文獻(xiàn)［6］，使大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）前段及其側(cè)支血流阻斷2 h，此時(shí)大腦前動(dòng)脈血流不受影響，造成MCA 局部缺血，待抽回尼龍線，MCA 血流恢復(fù)后，完成大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模。Sham組不做血管結(jié)扎或阻塞，其余操作同Model 組。造模后第1 天開(kāi)始，NBP 組、LY 組、NBP+LY 組分別腹腔注射10 mg∕kg NBP、10 mg∕kg LY和10 mg∕kg NBP+10 mg∕kg LY，注射劑量10 μL，每天1 次，連續(xù)給藥7 d，Sham 和Model 組腹腔給予等量生理鹽水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)倫［2017］第068 號(hào)。

1.3 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（nervous function defect score，NDS）第7 天給藥30 min 后，參考文獻(xiàn)［7］采用改良的mNNS 評(píng)分方法，將大鼠行為分為6 個(gè)等級(jí)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分：大鼠爬行正常沒(méi)有不對(duì)稱活動(dòng)；1 分：大鼠尾部垂直提起時(shí)前肢或后肢彎曲；2 分：大鼠在1 分的基礎(chǔ)上伴有不能直線行走；3 分：大鼠爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；4 分：大鼠自由活動(dòng)時(shí)向左側(cè)傾倒；5 分：大鼠在4 分的基礎(chǔ)上出現(xiàn)左前爪后拖；6 分：大鼠肢體完全不能支撐身體，無(wú)法自發(fā)爬行。

1.4 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）法測(cè)量腦梗死體積大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分結(jié)束后，隨機(jī)選取6 只大鼠，使用磁共振掃描儀檢測(cè)腦梗死體積，大鼠取仰臥位，找到標(biāo)準(zhǔn)軸位后，在橫斷面T2-加權(quán)成像的基礎(chǔ)上進(jìn)行冠狀面3 層掃描，層厚度1.5 mm，間距0.2 mm。T2-加權(quán)成像檢測(cè)大鼠腦梗死體積，梗死區(qū)域?yàn)樯n白色，正常腦組織區(qū)域?yàn)榛疑?。利用Image J 分析軟件計(jì)算腦梗死體積（%）=（梗死區(qū)體積∕全腦組織體積）×100%。

1.5 尼氏染色檢測(cè)腦組織中神經(jīng)元數(shù)目大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分結(jié)束后，隨機(jī)挑取6 只，麻醉后胸腹切口，在露出的心臟左心室插管，4%多聚甲醛心內(nèi)灌注至整個(gè)肝臟變?yōu)榘咨〕鐾暾哪X組織至冰器皿上并即刻以4%多聚甲醛固定，再用梯度乙醇在真空條件下脫水二甲苯透明后用石蠟將腦組織包埋處理。處理好的腦組織進(jìn)行5 μm 厚的冠狀切片參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行尼氏染色。光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察每組切片6 個(gè)不同的視野，并通過(guò)Image-Pro 6.2 軟件處理圖像，觀察缺血側(cè)大腦皮層區(qū)域內(nèi)完整神經(jīng)元的數(shù)目。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)Akt、P-Akt、GSK-3β、PGSK-3β大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分結(jié)束后，隨機(jī)挑取6 只，斷頭處死動(dòng)物，迅速剝離顱骨取缺血側(cè)半腦組織在冰浴條件下分離大腦皮質(zhì)，加入RIPA 組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min 后離心，離心條件：13 000 r∕min，4 ℃，時(shí)間10 min，獲得上清，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行上清中蛋白濃度的定量檢測(cè)，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，用Tris∕甘氨酸緩沖液將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%TBST 液中室溫封閉2 h，將PVDF 膜放入相應(yīng)一抗稀釋液（均為1∶1 000）中孵育，4 ℃過(guò)夜。次日，將膜取出，TBST 液洗滌10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗稀釋液（均為1∶10 000），室溫孵育2 h，加入DAB 發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NBP對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響與Sham組相比，Model 組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-60.335，P ＜0.001），經(jīng)NBP 治療后，與Model 組相比，NBP 組 神經(jīng)功能損傷評(píng)分出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-32.025，P ＜0.001），LY 組、NBP ＋LY 組 與Model 組比較組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.165，P=0.251；t=0.920，P=0.363）。見(jiàn)圖1。

圖1 NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)功能的影響Fig.1 Effect of NBP on neural function in MCAO rats

2.2 NBP對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響Sham組大鼠兩側(cè)腦組織未發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域，與Sham 組相比，Model 組腦梗死體積明顯增大（t=-146.485，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組腦梗死體積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-49.422，P ＜0.001）。LY 組、NBP＋LY 組與Model 組相比組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.058，P= 0.297；t= 1.758，P=0.087）。見(jiàn)圖2。

圖2 NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦梗死體積的影響Fig.2 Effect of NBP on cerebral infarction volume in MCAO rats

2.3 NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元完整性的影響神經(jīng)元經(jīng)過(guò)尼氏染色在光鏡下觀察呈藍(lán)紫色，如圖3、4 所示，Sham 組神經(jīng)元形態(tài)正常，與Sham 組相比，Model 組神經(jīng)元出現(xiàn)異常結(jié)構(gòu)，完整的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.220，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組腦組織內(nèi)完整神經(jīng)元的數(shù)量明顯升高（t= 28.354，P ＜0.001），LY 組、NBP + LY 組與Model 組相比組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.4925，P= 0.625；t=0.913，P=0.367）。

圖3 尼氏染色觀察NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元完整性的影響（×400）Fig.3 Effect of NBP on neuronal integrity in MCAO rats was observed by Nissl staining（×400）

圖4 各組完整神經(jīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)比較Fig.4 Comparison of the number of intact neurons among 5 groups

2.4 NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦組織中Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β表達(dá)的影響為了進(jìn)一步觀察NBP 對(duì)大鼠缺血腦梗死的作用機(jī)制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)了缺血區(qū)腦組織中Akt、PAkt、GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示與Sham 組相比，Model 組中Akt、GSK-3β磷酸化水平明顯下降（t= 14.536，P ＜0.001；t= 87.131，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組大鼠腦 組 織 中Akt、GSK-3β磷酸化明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.830，P ＜0.001；t= 64.879，P ＜0.001），LY 組、NBP ＋LY 組Akt、GSK-3β 磷酸 化水 平與Model 組相比組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P-Akt：t=-0.070，P= 0.944；P-GSK-3β：t= 10.413，P=0.682）；（P-Akt：t= 1.542，P= 0.131；P-GSK-3β：t=1.422，P=0.158）。見(jiàn)圖5。

3 討論

大腦是機(jī)體生理功能最為復(fù)雜的器官之一，對(duì)血液供應(yīng)具有極強(qiáng)的依賴性，當(dāng)大腦供血的動(dòng)脈發(fā)生狹窄或阻斷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腦組織因供血供氧不足出現(xiàn)局部缺血甚至壞死，大腦功能受到損害，對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響［8-9］。缺血性腦梗死與心血管疾病和惡性腫瘤并列成為對(duì)人類生命構(gòu)成極大威脅的致死性疾病［10］。

對(duì)于缺血性腦梗死進(jìn)行的藥物研發(fā)在醫(yī)學(xué)界受到極大重視，NBP 作為缺血性腦血管疾病的治療藥物，在臨床上得到廣泛使用，且效果顯著。本研究采用大鼠腦中動(dòng)脈阻塞法構(gòu)建局部腦缺血損傷再灌注模型，Model 組大鼠出現(xiàn)腦梗死體積明顯增大，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，且神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目增多。本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇NBP 給藥濃度。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)NBP 治療的大鼠與Model 組相比，腦梗死體積明顯縮小，神經(jīng)功能損傷程度明顯減輕，同時(shí)抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，大鼠局部腦缺血損傷得到緩解，該結(jié)果與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［11］，再次證實(shí)了藥物的治療效果。

圖5 NBP 對(duì)MCAO 大鼠腦組織中Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of NBP on the expression of Akt，P-Akt，GSK-3β and P-GSK-3βgsk-3 in MCAO rats

研究藥物的分子機(jī)制，探尋藥物作用的靶點(diǎn)有利于藥物的使用及藥物的優(yōu)化。以往的研究結(jié)果表明，線粒體是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件，NBP 可通過(guò)提高線粒體三磷酸腺苷（ATP）酶的活性，對(duì)因缺血造成損傷的細(xì)胞線粒體起到保護(hù)作用，從而抑制細(xì)胞凋亡［12］。此外研究顯示NBP 可能通過(guò)作用于大腦缺血部位，提高位血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)大腦損傷的保護(hù)作用［13］。因研究結(jié)果缺少干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于途徑未進(jìn)行深入研究。LY294002 作為PI3K 特異性抑制劑，可特異性抑制PI3K110 亞基單元的活性，阻斷PI3K 介導(dǎo)的信號(hào)通路。本研究中使用LY294002 驗(yàn)證NBP 對(duì)PI3K∕Akt∕GSK3β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)保護(hù)局部腦損傷的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，Akt 和GSK-3β磷酸化水平在NBP 組與Model 組相比大幅增加，而LY+NBP 組較NBP 組下降明顯，LY294002 逆轉(zhuǎn)了NBP 介導(dǎo)的Akt 和GSK3β磷酸化水平，說(shuō)明NBP 可通過(guò)PI3K來(lái)實(shí)現(xiàn)Akt 和GSK3β磷酸化進(jìn)程。有研究［14］表明，PI3K∕Akt∕GSK-3β信號(hào)通路抑制了大腦再灌注損傷后細(xì)胞的凋亡，同時(shí)在后期參與了其修復(fù)過(guò)程，對(duì)于抑制缺血后腦梗死面積擴(kuò)大起到保護(hù)作用。與NBP 組相比，LY+NBP 組大鼠腦梗死體積明顯增大，神經(jīng)功能損傷程度更為嚴(yán)重，且神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量增加，證明了NBP 可能是通過(guò)調(diào)控PI3K∕Akt∕GSK-3β信號(hào)通路在大腦缺血損傷中起保護(hù)作用。

綜上所述，NBP 可以激活缺血性腦梗死所致的PI3K∕Akt∕GSK-3β 信號(hào)的激活，從而減輕神經(jīng)功能損害，發(fā)揮對(duì)局部缺血致腦梗死的保護(hù)作用。但NBP 是否還能通過(guò)調(diào)節(jié)其他通路來(lái)影響疾病進(jìn)程，仍需進(jìn)一步的研究。