郭 艷， 吳青青， 汪電雷， 黃和平， 俞 娟

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

青黃散是由青黛和雄黃兩味中藥組成,以青黛為君藥,具有涼血解毒、散瘀消積之功效,早在《世醫(yī)得效方》和《奇效良方》中就有記載,屬砷復(fù)合制劑[1]。方中青黛味咸、性寒,入肝經(jīng),能清熱解毒,涼血消斑,瀉火定驚,宜沖服或入丸散,其主要化學(xué)成分為靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮,具有抗菌消炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、保肝[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)等作用[6-7]。靛玉紅是青黛抗白血病的主要藥效成分,對慢性粒細(xì)胞白血病具有明顯抑制作用[8]。雄黃辛溫有毒,可解百毒,消積聚,化腹中瘀血[9-10],其主要成分二硫化二砷(As2S2)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,降低端粒酶活性,以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-14]。雄黃外敷具有消炎、抗病毒等作用[15],內(nèi)服具有抗風(fēng)濕、抗腫瘤的作用,常用于急性髓系白血病在內(nèi)的多種惡性血液病的治療[16]。雄黃遇熱易轉(zhuǎn)化為有毒的As2O3,通過“水飛法”炮制雄黃以去除可溶性的As2O3,降低其毒性[17-18]?，F(xiàn)代藥理研究表明,青黛與雄黃伍用可顯著增強(qiáng)其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用,常被用于血液疾病如白血病、骨髓增生異常綜合征等的治療[19-21]。研究發(fā)現(xiàn),青黃散中青黛和雄黃不同劑量配比對體內(nèi)砷的變化規(guī)律,結(jié)果表明青黃散中青黛比例的增加能促進(jìn)大鼠體內(nèi)砷的吸收[22]。為進(jìn)一步考察青黛與雄黃配比變化對大鼠體內(nèi)青黛指標(biāo)性成分的藥動學(xué)行為及青黛吸收的影響,本實(shí)驗(yàn)固定方中青黛的劑量,通過改變雄黃的劑量,采用UPLC-MS/MS法測定給藥后血中青黛指標(biāo)成分色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)的濃度并比較其藥動學(xué)參數(shù),深入探討其在體內(nèi)的相互作用關(guān)系,為其在臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Triple Quad TM 4500 質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司);AS5150A型超聲清洗儀(Autoscience公司);Dragonmed移液器(上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司);BP211D型電子天平(德國Sartorius公司);Milli-Q超純水器(美國 Millipore公司)。

1.2 供試材料

青黛(批號:170907)和雄黃(批號:171023)均購于安徽省亳州中藥材市場,并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為正品。標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥98%):靛玉紅(批號:110717)和靛藍(lán)(批號:67707224)均購于中國食品藥品檢定研究院;色胺酮(韶遠(yuǎn)科技上海有限公司,批號:SY017117);卡馬西平(成都德斯特生物技術(shù)有限公司,批號DST171120-318);N,N-二甲基甲酰胺(色譜純,上海阿拉丁生化科技有限公司);乙腈(色譜純,合肥科申化工有限公司);水為超純水,其余試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)動物

雄性SD大鼠,體質(zhì)量為180～220 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:SCXK(皖)2017-001,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,可自由飲水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件與質(zhì)譜條件 Kinetex C18(100 mm×2.10 mm, 1.7 μm)色譜柱,流動相為乙腈-水(53∶47,V/V),流速為0.2 mL/min, 柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為2 μL。采用電噴霧離子化(ESI)以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行正離子掃描。氣路參數(shù):噴霧電壓(IS)為5.5 kV,離子化溫度(TEM)為550 ℃;碰撞氣(CAD)為10 psi、霧化氣(GS1)為18 psi、加熱氣(GS2)為55 psi。用于定量分析的離子對和去簇電壓(DP)及碰撞電壓(CE)分別為:m/z 249.2→130.0,60 eV,38.63 eV(色胺酮);m/z 263.0→235,77.22 eV,34.3 eV(靛玉紅);m/z 263.0→235,77.22 eV,34.3 eV (靛藍(lán));m/z 237.2→194.1,104.04 eV,27.8 eV (卡馬西平)。

1.4.2 供試品的制備 稱取1.0 g雄黃于研缽中,加0.5 mL水研磨5 min至糊狀,再向研缽中加入40 mL水?dāng)嚢? min,靜置4 min,取混懸液,下沉的粗粉繼續(xù)研磨,反復(fù)操作10次,合并混懸液,靜置10 h以上,取下沉物冷凍干燥[23-24]。稱取3份青黛粉末各10.0 g,按照190.0∶1、95.0∶1、47.5∶1的配比分別稱取上述冷凍干燥后的雄黃52.6、105.3、210.5 mg,然后均以18 mL 0.5% CMC-Na和2 mL乙醇制成溶液,灌胃給藥,給藥體積為10 mL/kg。

1.4.3 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 稱取適量各對照品,分別用N,N-二甲基甲酰胺溶解,得到濃度均為100 μg/mL的各對照品儲備液。分別移取不同體積各儲備液于10 mL容量瓶中, 乙腈定容, 得色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)濃度分別為200、2 000和2 000 ng/mL的混合對照品儲備液。精密稱取卡馬西平1.00 mg于10 mL容量瓶,乙腈溶解并定容,得濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。取適量該儲備液,用乙腈稀釋成濃度為0.1 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血漿樣品處理 取血漿90 μL置于1.5 mL EP管中,加入10 μL內(nèi)標(biāo)和750 μL乙酸乙酯,渦旋3 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,氮吹,加50 μL乙腈復(fù)溶,渦旋混勻,再次12 000 r/min離心10 min,取上清液。

1.5 藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取18只SD大鼠,隨機(jī)分為A、B、C三組,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,可自由飲水。以青黛劑量為5 g/kg,雄黃劑量分別為0.026 g/kg(A組)、0.053 g/kg(B組)、0.105 g/kg(C組)的配比進(jìn)行大鼠灌胃給藥,并于給藥前和給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、600 min眼底靜脈叢取血0.3 mL,置于經(jīng)肝素處理的EP管中,3 500 r/min離心10 min,分離出血漿,按“1.4.4”節(jié)下血漿樣品處理操作,進(jìn)樣分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用DAS 2.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)的計(jì)算。采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

分別取大鼠空白血漿、空白血漿加內(nèi)標(biāo)、空白血漿加內(nèi)標(biāo)和混合對照品溶液以及給藥6 h后的大鼠血漿樣品,按“1.4.4”節(jié)進(jìn)樣分析。如圖1所示, 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對色胺酮、靛玉紅、靛藍(lán)和卡馬西平的測定無干擾。

圖1 大鼠空白血漿(A)、空白血漿加內(nèi)標(biāo)(B)、空白血漿加內(nèi)標(biāo)和混合對照品溶液(C)以及青黛∶雄黃=95∶1配伍給藥6h后的大鼠血漿樣品(D)的MRM色譜圖,1.卡馬西平;2.色胺酮;3.靛藍(lán);4.靛玉紅Fig.1 MRM chromatograms of rat blank plasma (A), blank plasma plus internal standard (B), blank plasma plus internal standard and mixed reference solution (C), as well as rat plasma samples after 6 h of administration (D, indigo naturalis∶realgar=95∶1), 1. Carbamazepine; 2. Tryptanthrin; 3. Indigo; 4. Indirubin

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用乙腈依次稀釋混合對照品儲備液,得到色胺酮濃度為2,4,10,20,50,100,200 ng/mL,靛玉紅和靛藍(lán)濃度分別為20,40,100,200,500,1 000,2 000 ng/mL的混合對照品溶液。取大鼠空白血漿90 μL,分別加入10 μL一系列混合工作液和750 μL乙酸乙酯,按“1.4.4”節(jié)下進(jìn)樣分析。以樣品濃度為橫坐標(biāo)(x),以樣品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到方程:色胺酮:y=0.557x+0.327 4(r=0.996 1);靛玉紅:y=0.010 3x-0.000 6(r=0.998 2);靛藍(lán):y=0.053 7x+0.229 6(r=0.997 3)。結(jié)果表明,色胺酮在0.2～20 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,靛玉紅和靛藍(lán)在2～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.3 準(zhǔn)確度考察

取大鼠空白血漿90 μL,加入一定量不同濃度的混合對照品溶液,分別配制成色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)定量下限(0.2,2,2 ng/mL)、低(0.4,4,4 ng/mL)、中(2,20,20 ng/mL)、高(10,100,100 ng/mL)濃度的質(zhì)控樣品,每個濃度平行5份,重復(fù)3個分析批,按“1.4.4”節(jié)下進(jìn)樣分析。結(jié)果如表1～3所示。

表1 色胺酮準(zhǔn)確度測定(n=5)

表2 靛玉紅準(zhǔn)確度測定(n=5)

表3 靛藍(lán)準(zhǔn)確度測定(n=5)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

以大鼠空白血漿經(jīng)乙酸乙酯處理后的空白基質(zhì)上清液和乙腈為溶劑,分別配制含基質(zhì)和不含基質(zhì)的色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)低、中、高濃度的質(zhì)控樣品,每個濃度平行5份,進(jìn)樣分析。每個分析物及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子為基質(zhì)存在下的峰面積(由乙酸乙酯處理后的空白血漿加入分析物和內(nèi)標(biāo)測得)與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積(分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?的比值。分析物與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子的比值即為內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果表明內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的RSD均小于15%, 表明血漿基質(zhì)對3種物質(zhì)的測定影響較小。

2.5 提取回收率

以空白血漿90 μL,加入色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)低、中、高濃度的混合對照品溶液, 按血漿樣品處理方法處理后的測定峰面積為A1,空白血漿樣品按血漿樣品處理方法處理后加入色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)低、中、高濃度的混合對照品測定的峰面積為A2,提取回收率=A1/A2×100%。結(jié)果表明低、中、高濃度下3種物質(zhì)的提取回收率均大于85%,符合生物樣品分析要求。

2.6 穩(wěn)定性考察

配制色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)低、中、高濃度的質(zhì)控樣品,每個濃度平行5份。樣品分別經(jīng)反復(fù)凍融3次、室溫放置6 h以及4 ℃放置24 h后, 按“1.4.4”節(jié)下進(jìn)樣分析。結(jié)果表明低、中、高濃度下3種物質(zhì)的RE均小于15%,表明這3種物質(zhì)在上述條件下均穩(wěn)定。

2.7 青黛三種指標(biāo)成分的血藥濃度-時間曲線及其主要藥代動力學(xué)參數(shù)

色胺酮、靛玉紅和靛藍(lán)的平均血藥濃度-時間曲線如圖2～4所示。采用DAS 2.0軟件進(jìn)行分析,得到的主要藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表4～6。

圖2 色胺酮平均血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of tryptanthrin

圖3 靛玉紅平均血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.3 Mean plasma concentration-time curve of indirubin

圖4 靛藍(lán)平均血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.4 Mean plasma concentration-time curve of indigo

參數(shù)A組B組C組 AUC0-t/(h·ng/mL)5.21 ± 1.636.67 ± 8.066.06 ± 5.37 MRT0-t/(h·ng/mL)3.72 ± 0.653.65 ± 0.323.24 ± 0.76 T1/2/h3.47 ± 1.013.57 ± 1.173.72 ± 1.48 Tmax/h0.38 ± 0.1370.46 ± 0.100.51 ± 0.29 Cmax/(ng/mL)1.52 ± 0.321.97 ± 2.272.45 ± 2.49

表5 大鼠灌胃給藥后靛玉紅主要藥動學(xué)參數(shù)

注:C組與A組比較,*P< 0.05;C組與B組比較,#P< 0.05。下同。

表6 大鼠灌胃給藥后靛藍(lán)主要藥動學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論與討論

前期研究比較了甲醇、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺等溶劑超聲溶解效果,結(jié)果顯示色胺酮、靛玉紅及靛藍(lán)在N,N-二甲基甲酰胺中均能較好地溶解,故實(shí)驗(yàn)選用N,N-二甲基甲酰胺溶解這三種物質(zhì)?？R西平以及各對照品在相同色譜條件下出峰位置合適,且無組分峰影響,實(shí)驗(yàn)選用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)物。青黛難溶于水,實(shí)驗(yàn)采用0.5%CMC-Na和少量乙醇溶解青黛粉末以制成混懸液灌胃給藥。關(guān)于生物樣品前處理,用乙酸乙酯萃取青黛中的靛玉紅,乙腈沉淀蛋白效果好,氮吹效率高[23]。本實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇-水、乙腈-水的不同比例流動相,結(jié)果表明以乙腈-水(53∶47,V/V)作為流動相時,待測物響應(yīng)值較高,分離效果較好,因而實(shí)驗(yàn)選用乙腈-水(53∶47,V/V)為流動相進(jìn)行指標(biāo)成分濃度的測定。

一般來說,中藥復(fù)方不同配比的選擇可直接影響其臨床療效與安全[24]。青黃散中隨著雄黃劑量的增大,其治療白血病的效果增加,但雄黃劑量過大會造成體內(nèi)砷蓄積而引起一系列毒副作用[25]。青黃散中青黛與雄黃常用比例為7∶3、8∶2、9∶1,但可能由于儀器等實(shí)驗(yàn)條件受限,前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),青黛在較低劑量時很難同時測定青黛中三種指標(biāo)成分的體內(nèi)濃度。本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上,通過比例調(diào)整,分別以青黛與雄黃比例為190.0∶1、95.0∶1和47.5∶1進(jìn)行大鼠灌胃給藥,測定給藥后血中青黛指標(biāo)成分的濃度并比較其藥動學(xué)參數(shù),探討不同配比的青黛與雄黃伍用對體內(nèi)青黛吸收的影響。結(jié)果顯示,隨著雄黃劑量的增大,色胺酮的Cmax、AUC0-t和MRT均無顯著變化(P>0.05),說明雄黃劑量變化不影響色胺酮的吸收;靛藍(lán)的Cmax和AUC0-t均顯著增大(P<0.05),說明雄黃劑量增加能促進(jìn)青黛中靛藍(lán)的吸收[22];靛玉紅的Cmax和AUC0-t均減小(P<0.05),可能是由于青黛中的靛玉紅與雄黃中的砷化物相互作用形成有機(jī)配合物發(fā)揮其抗腫瘤作用而使血中靛玉紅濃度降低,這可能是青黛與雄黃伍用治療白血病效果更優(yōu)的一個原因[26]。綜上可知,不同配比的青黛與雄黃伍用時,青黛的體內(nèi)藥動學(xué)行為發(fā)生改變,雄黃劑量增大能促進(jìn)青黛吸收,但不是促進(jìn)全部有效成分吸收。而對于青黛與雄黃伍用治療血液疾病的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。