李迎曉 程輝 李運(yùn) 焦鳳超

摘? 要：對(duì)豫北地區(qū)某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的疑似雞心包積液綜合征病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。結(jié)果表明：病死雞剖檢可見典型的心包積液、肝炎病理特征。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，從肝臟病料中檢測(cè)出約830 bp大小的片段;序列分析結(jié)果表明，該段hexon基因核苷酸序列與Genbank中登錄的FAdV-4基因序列的同源性高達(dá)99.8%以上，確定該養(yǎng)殖場(chǎng)是由血清4型腺病毒感染而引起的心包積液綜合征。

關(guān)鍵詞：禽腺病毒I型;心包積液綜合征;分離與鑒定;Hexon

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）是現(xiàn)代禽類養(yǎng)殖場(chǎng)中常見的病原體之一，分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群，其中Ⅰ群有5個(gè)基因型（A～E）、包含12個(gè)血清型。FAdV-4是引起心包積液-肝炎綜合征的主要病原[1]。自2015年6月份以來，雞心包積液綜合征在國內(nèi)大面積流行，已成為目前危害養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病之一[2-8]。2019年7月實(shí)驗(yàn)室接診了豫北某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的疑似心包積液綜合征病例，通過實(shí)驗(yàn)室診斷確定為FAdV-4感染，現(xiàn)報(bào)道如下，以期為該地區(qū)土雞心包積液綜合征的防控提供有效參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病料來源? 2019年7月豫北某土雞養(yǎng)殖戶送檢的疑似禽腺病毒感染病死雞。

1.1.2? 主要試劑? 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，購自杭州濱河微生物試劑有限公司;無菌脫纖綿羊血，購自上海一研生物科技有限公司;DNA提取試劑盒，購于捷瑞生物工程（上海）股份有限公司;即用PCR試劑盒，購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病理解剖與病變觀察? 按常規(guī)術(shù)式解剖病雞，觀察內(nèi)臟器官病理變化。

1.2.2? 細(xì)菌學(xué)檢查? 用接種環(huán)蘸取肝臟和脾臟病料劃線接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～36h檢查有無細(xì)菌生長。

1.2.3? PCR鑒定

1.2.3.1? 組織DNA的提取? 采集部分肝臟組織剪碎并充分研磨，取上清液按照DNA提取試劑盒說明書操作提取病毒基因，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2? 引物設(shè)計(jì)和PCR檢測(cè)? 參考文獻(xiàn)[9]，設(shè)計(jì)針對(duì)禽腺病毒的Hexon序列保守序列特異性引物，目標(biāo)條帶約為830bp，序列見表1。

PCR反應(yīng)體系50μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，模板1μL，超純水20μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min;94℃ 30S，55℃ 45S，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。并將PCR陽性樣品送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序和同源性分析。

2? 結(jié)果

2.1? 病理解剖與病變觀察? 剖檢6只病、死雞，主要眼觀病理變化為心包內(nèi)有大量淡黃色透明積液（圖1），肝臟腫大并伴有出血點(diǎn)（圖2），腎臟腫大呈花斑狀。

2.2? 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果? 肝臟和脾臟病料接種的鮮血瓊脂平板，經(jīng)過培養(yǎng)后無可見細(xì)菌生長。

2.3? PCR鑒定結(jié)果? 電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出一條長度約830bp大小條帶，見圖3。測(cè)序結(jié)果表明，分離株的Hexon基因序列與登錄號(hào)為KT899325.1、KU877412.1、KX364100.1和UKY229710.1的基因序列同源性分別為99.9%、99.8%、99.9%以及99.9%，提示所分離的病毒為腺病毒血清4型，命名為XY，見圖4所示。

3? 結(jié)論與討論

本研究通過剖檢可見病雞心包內(nèi)有大量淡黃色積液、肝臟腫大出血、部分顏色發(fā)黃、壞死、具有禽腺病毒感染的臨床癥狀，以及PCR結(jié)果和序列分析結(jié)果表明因Hexon的基因核苷酸序列Genbank中登錄的部分FAdV-4的基因序列同源性高達(dá)99.8%以上。由此確定，本次在豫北地區(qū)某土雞養(yǎng)殖場(chǎng)疫情為血清4型腺病毒感染。相關(guān)的報(bào)道也證實(shí)美洲、亞洲的部分國家和中國出現(xiàn)的心包積液型肝炎綜合征主要由FAdV-4型感染引起的[10]。

由于該病毒具有垂直傳播的特點(diǎn)，因此凈化種雞是一項(xiàng)非常重要的防控工作。在發(fā)生過本病的雞場(chǎng)，應(yīng)及時(shí)更新免疫計(jì)劃，將禽腺病毒疫苗納入養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序;另外，要建立及時(shí)有效的疾病診斷方法，能夠在疾病發(fā)生初期正確診斷并采取最有效的防治措施，將有利于疾病的防控。在疫情發(fā)生早期時(shí)，要及時(shí)使用高免卵黃抗體配合抗菌藥物預(yù)防繼發(fā)感染，能有效降低死亡率，控制疫情的傳播。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 陳傅言.獸醫(yī)傳染病學(xué)（第六版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015： 389-394.

[2]? ZHAO J，ZHONG Q，ZHAO Y，et al. Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China[J].PLoS One，2015，1（7）： e133073.

[3]? LI H，WANG J，QIU L，et al. Fowl adenovirus species C serotype 4 is attributed to the emergence of hepatitis-hydropericardium syndrome in chickens in China[J]. Infection Genetics & Evolution，2016（45）： 230.

[4]? ?羅玲， 趙康， 張媛， 等. 雞心包積水綜合征病原的分離與鑒定[J]. 中國家禽， 2016， 38（6）： 56-58.

[5]? 于可響， 黃兵， 凌紅麗， 等. 山東省血清4型禽腺病毒的分離鑒定[J]. 中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)， 2016， 24（05）： 1-5.

[6]? 羅洋洋， 招麗嬋， 李群輝， 等.Ⅰ群禽腺病毒血清4型廣東株的分離鑒定及分子特性[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 38（06）： 27-33.

[7]? 趙玉杰， 劉建勛， 陳田田， 等. 血清4型禽腺病毒W(wǎng)株的分離鑒定和全基因組序列分析[J/OL]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2019（07）： 2059-2068[2019-07-29].https：//doi.org/10.16431/j.cnki.1671-7236.2019.07.022.

[8]? 李榮旭， 曹夢(mèng)蕊， 伍輝吉， 等. 1例雞源血清4型禽腺病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].中國獸醫(yī)雜志， 2019， 55（02）： 54-56.

[9]? Xie Z， Fadl A A， cirshiek T， et al. Detection of avian adenovirus by polymerase chain reaction [J]. avian Dis， 1999， 43（1）： 98-105.

[10] Schachner A，Matos M，Grafl B，et al.Fowl adenovirus （FAdV） induced diseases and strategies for their control - a review on the current global situatio[J].Avian Pathology，2018， 47（2）：111-126.