吳銳，潘茲書

1. 貴州省人民醫(yī)院生殖中心，貴陽(yáng) 550002; 2. 武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)為黃病毒科瘟病毒屬成員，是引起豬急性、發(fā)熱性與接觸性傳染病——豬瘟的病原體。CSFV基因組為1條長(zhǎng)約12.3 kb的單股正鏈RNA，包括位于兩端的非編碼區(qū)和中間編碼多聚蛋白的開放讀碼框。多聚蛋白經(jīng)過(guò)細(xì)胞與病毒的蛋白酶加工后形成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。

CSFV 4種結(jié)構(gòu)蛋白分別是核衣殼Core蛋白、包膜蛋白Erns、E1和E2[1]。Core蛋白在基因組編碼的多聚蛋白上位于N端蛋白酶Npro與糖蛋白Erns之間。Core蛋白的成熟包括Npro蛋白酶水解多聚蛋白，形成Core蛋白的N端及細(xì)胞信號(hào)肽酶加工產(chǎn)生Core蛋白的C端[2-4]。通過(guò)Core蛋白缺失突變體的CSFV感染性cDNA克隆，研究人員發(fā)現(xiàn)Core蛋白的N端與C端在病毒顆粒形成中發(fā)揮重要作用[5]。用缺失Core蛋白的CSFV感染性cDNA克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞，連續(xù)傳代后獲得的NS3突變以補(bǔ)償Core蛋白缺失的功能，產(chǎn)生的CSFV毒力降低[6]，表明Core蛋白在決定CSFV毒力中有重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)Core蛋白的SUMO化位點(diǎn)或IQGAP1相互作用位點(diǎn)進(jìn)行突變，可導(dǎo)致CSFV毒力減弱[7-8]。研究表明Core蛋白對(duì)病毒的包裝及其毒力具有十分重要的作用，但目前關(guān)于Core蛋白在細(xì)胞中的定位與功能的關(guān)系研究報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Core蛋白、截短突變體及氨基酸位點(diǎn)突變體在細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)Core蛋白的核仁定位序列為PESRKKL，關(guān)鍵氨基酸為R76K77。

1 材料與方法

1.1 材料

pEGFP-C1質(zhì)粒和PK15細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室制備，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購(gòu)自Thermo Fisher公司，質(zhì)粒提取試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，LipofectamineTM 2000購(gòu)自Invitrogen 公司，DAPI購(gòu)自 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-Core及Core蛋白突變體的構(gòu)建根據(jù)CSFV石門株基因組序列(NCBI NO.AF092448.2)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Core基因及其突變體的引物，在引物兩端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以CSFV石門株感染性cDNA克隆為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增Core蛋白基因及其截短突變體。將擴(kuò)增得到的DNA片段和pEGFP-C1質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收，并用T4連接酶進(jìn)行連接，獲得pEGFP-Core及其截短的重組質(zhì)粒。利用重疊PCR擴(kuò)增法獲得Core蛋白基因點(diǎn)突變DNA片段，采取上述重組質(zhì)粒構(gòu)建方法獲得了pEGFP-Core突變體。重組質(zhì)粒由上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 轉(zhuǎn)染提取足量的pEGFP-C1、pEGFP-Core蛋白及其突變體的重組質(zhì)粒。將培養(yǎng)狀態(tài)良好的PK15細(xì)胞種植于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)6 h 左右。當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%～90%時(shí)，用LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作：分別配置A液(3 μg質(zhì)粒、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基)和B液(10 μL LipofectamineTM 2000、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基)，室溫孵育5分鐘后，混勻A液與B液，繼續(xù)室溫孵育20分鐘，加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中并混勻。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后的PK15細(xì)胞用PBS清洗，經(jīng)甲醇-丙酮固定液(1∶1)固定后，DAPI染色。LAS AF Lite 4.0共聚焦熒光顯微鏡(Leica, Germany)下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 Core蛋白定位于胞質(zhì)及核仁

為研究CSFV Core蛋白在PK15細(xì)胞的定位分布情況，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Core，轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞后觀察Core蛋白與EGFP融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，對(duì)照組EGFP均勻分布于整個(gè)細(xì)胞，而在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-Core的PK15細(xì)胞的EGFP-Core除胞質(zhì)定位外還具有明顯的核仁定位分布(圖1)，這與早期Core蛋白核仁定位的研究結(jié)論一致[9]。

2.2 Core蛋白核仁定位序列為PESRKKL

為鑒定Core蛋白核仁定位序列，構(gòu)建3個(gè)pEGFP-Core截短突變體重組質(zhì)粒(圖2A)。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞，熒光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，EGFP-Core M1與EGFP定位情況類似，表明Core M1不存在定位Core蛋白的特異序列；EGFP-Core M2與EGFP-Core定位情況類似，存在明顯的核仁定位，表明Core蛋白的核仁定位序列位于Core蛋白的第36位與第81位氨基酸之間；EGFP-Core M3只定位在胞質(zhì)內(nèi)，沒有細(xì)胞核仁定位(圖2B)。

為進(jìn)一步確認(rèn)Core蛋白的核仁定位序列，利用PSORTII計(jì)算機(jī)程序(https://psort.hgc.jp/form2.html)對(duì)Core M2進(jìn)行核仁定位序列分析。分析結(jié)果顯示，73～79位氨基酸序列(PESRKKL)可能是潛在的核仁定位序列。為了驗(yàn)證PESRKKL序列是否是Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵序列，構(gòu)建了pEGFP-Core M4(Δ73～79)重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞。熒光顯微鏡顯示，EGFP-Core M4(Δ73～79)沒有核仁定位(圖2B)， 表明PESRKKL序列是CSFV Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵序列。

圖1 CSFV Core蛋白在PK15細(xì)胞的定位分析

Fig.1 Analyze the localization of CSFV Core protein in PK15 cells

A: Amino acids sequence of CSFV Core and its truncated mutants diagram. B: Immunofluorescence analysis of truncated CSFV Core protein in PK15 cells.

圖2 CSFV Core蛋白、截短突變體的亞細(xì)胞定位

Fig.2 Subcellular localization of truncated CSFV Core mutants

2.3 Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵氨基酸為R76K77

為進(jìn)一步定位Core蛋白核仁定位序列的關(guān)鍵氨基酸，將Core蛋白核仁定位序列的氨基酸依次突變?yōu)楸彼?圖3A和圖3B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PESRKKL序列的單個(gè)氨基酸突變并不影響Core蛋白的核仁定位(圖3C)。

根據(jù)黃病毒科其他病毒Core蛋白的核仁定位序列研究，推測(cè)PESRKKL序列的連續(xù)2個(gè)堿性氨基酸序列可能是該序列核仁定位的關(guān)鍵氨基酸。因此，構(gòu)建了EGFP-Core的突變體R76A/K77A(圖3A和圖3B)。觀察發(fā)現(xiàn)，突變體R76A/K77A不存在核仁定位(圖3C)。以上結(jié)果表明R76K77是決定Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵氨基酸。

A: Core mutants with indicated amino acids mutation and its localization in PK15 cells. B: The alignment of sequencing results of Core mutants. C: Immunofluorescence analysis of Core mutants localization in PK15 cells.

圖3 CSFV Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵氨基酸鑒定

Fig.3 Identification of critical amino acids for nucleolus localization of CSFV Core

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CSFV Core蛋白的核仁定位序列位于73PESRKKL79。已有研究報(bào)道，CSFV Core蛋白的一個(gè)核仁定位序列位于51KKKGKV56[9]。因此,我們推測(cè)CSFV Core蛋白至少具有兩個(gè)核仁定位序列，缺失其中任何一個(gè)核仁定位序列都將導(dǎo)致Core蛋白的核仁定位功能喪失。

已有的研究表明，黃病毒科成員核心蛋白具有一個(gè)或多個(gè)核仁定位序列，對(duì)這些核仁定位序列進(jìn)行的突變都嚴(yán)重影響病毒的包裝與復(fù)制。例如，乙型腦炎病毒Core蛋白的G42P43[10]，登革病毒Core蛋白的K73K74A和R85K86[11]以及丙型肝炎病毒Core蛋白第5～13、38～43和112～117位氨基酸[12]都是決定Core蛋白核仁定位的關(guān)鍵氨基酸。那么CSFV Core蛋白的核仁定位對(duì)病毒復(fù)制具有怎樣的意義？有文獻(xiàn)報(bào)道，缺失Core蛋白第51～57位或第71～78位氨基酸分別導(dǎo)致轉(zhuǎn)染感染性克隆24 h后病毒滴度降低87.5%和93.75%[5]。可見，CSFV Core的核仁定位對(duì)病毒顆粒具有一定的影響。而Core蛋白核仁定位序列的缺失對(duì)病毒基因組的復(fù)制與病毒毒力的影響尚未可知，有待進(jìn)一步的研究。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，第82～99位氨基酸序列具有較強(qiáng)的疏水性。研究結(jié)果顯示，EGFP-Core M3第82～99位氨基酸定位在胞質(zhì)而沒有細(xì)胞核仁定位，提示Core蛋白第82～99位氨基酸序列定位于細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮作用。在黃病毒科的其他病毒也有類似報(bào)道，如丙型肝炎病毒Core蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域第109～133位氨基酸是Core蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的重要出核信號(hào)序列，突變其中的疏水氨基酸都將導(dǎo)致Core蛋白的核仁定位減少[13]；登革病毒Core蛋白通過(guò)其內(nèi)部疏水序列第46～66位氨基酸定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，使得病毒顆粒與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)聯(lián)[14]。登革病毒Core蛋白的內(nèi)部疏水序列將病毒顆粒牽引到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成的脂滴上，促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制，從而影響登革病毒的復(fù)制[15]。位于CSFV Core蛋白第82～99位氨基酸促進(jìn)Core蛋白的核仁定位對(duì)病毒復(fù)制與包裝具有怎樣的功能還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)分析Core蛋白、截短突變體及氨基酸位點(diǎn)突變體與EGFP融合蛋白在PK15細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)了CSFV Core蛋白核仁定位序列和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究CSFV Core蛋白結(jié)構(gòu)與功能及其在病毒復(fù)制和組裝中的作用提供了依據(jù)。