崔 杰，李俊良，王琮玉，代翠紅，劉俊利，劉天嬌

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150000)

0 前 言

抗凍蛋白(antifreeze protein, AFP)是20世紀(jì)60年代從極地海魚的血清中發(fā)現(xiàn)的一種具有阻止體液內(nèi)冰核形成與生長、維持體液的非冰凍狀態(tài)的高效抗凍活性物質(zhì)[1]。按照來源抗凍蛋白可分為三種：魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白和植物抗凍蛋白。與魚類和昆蟲afp基因相比，植物afp基因的研究相對較晚。1992年，Griffith等第一次明確提出獲得植物內(nèi)源AFP，他們從經(jīng)過低溫鍛煉的能夠忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥葉片中提取并純化了該蛋白，在該蛋白濃度為60 mg/ml、溫度為-1.1℃時，可觀察到雙錐體或針狀冰晶[2]。同年，費云標(biāo)等先后以不同的方法首次從雪蓮和沙冬青中分離和部分純化了AFP，經(jīng)測定其冰點降低和熱滯活性均高于在冬黑麥中已獲得的AFP的活性，在50 mg/ml的濃度下，其熔點約為-15℃，抗凍活性比已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的魚類或黑麥都高很多[3]。陸續(xù)，有很多相關(guān)研究報道了胡蘿卜afp基因抗凍利用研究[4]。

甜菜是我國主要的糖料作物，在東北、華北、西北地區(qū)大面積種植。雖然與冷敏感植物相比，甜菜是一種比較耐寒的作物，但早春的晚霜和秋季的早霜凍害對甜菜苗期和糖分積累期的生長影響嚴(yán)重。因此，培育耐寒抗凍甜菜品種對北方甜菜的生產(chǎn)意義重大。本研究采用PCR方法從3種胡蘿卜中克隆了抗凍蛋白基因afp，經(jīng)測序比對、選擇其中一個基因通過構(gòu)建安全、環(huán)保的甜菜葉綠體表達(dá)載體，并利用基因槍法轉(zhuǎn)化甜菜葉柄，經(jīng)誘導(dǎo)分化、抗性篩選及對抗性植株P(guān)CR檢測，獲得了具有抗凍蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株，為快速培育耐寒抗凍甜菜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

胡蘿卜精選三紅五寸參(黑龍江哈爾濱地方品種)，日本黑心田五寸參(山東昌邑地方品種)及西北胡蘿卜(西北地方品種)；甜菜為哈爾濱工業(yè)大學(xué)甜菜課題組自育的二倍體品系72-204。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α為本課題組保存。pBM18-T Vector購自TAKARA公司，p16APT(含有葉綠體特性啟動子Prrn和終止子TpsbA)，pSAR(含有甜菜葉綠體同源片段atpB/rbcL)均由該實驗室構(gòu)建及保存[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 胡蘿卜基因組DNA的提取

采用CTAB提取法。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上afp基因的序列，設(shè)計引物，如下：

P1：5’-CGGGGTACCATGAATATTGAATCATC-3’

P2：5’-CGGACTAGTCTAGCATTCTGGCAATG-3’

以胡蘿卜基因組DNA為模板，反應(yīng)條件：95℃ 5 min→(95℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 3 min)30個循環(huán)→72℃ 10 min。

1.2.3 載體構(gòu)建

目的片段經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、檢測；測序由華大基因生物技術(shù)公司完成；表達(dá)載體構(gòu)建，將克隆的片段經(jīng)過一系列分子生物學(xué)手段構(gòu)建成表達(dá)載體，包含甜菜葉綠體基因組同源序列、外源基因表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒。

1.2.4 基因槍法轉(zhuǎn)化甜菜

構(gòu)建的表達(dá)載體采用基因槍法轉(zhuǎn)化甜菜葉柄，經(jīng)組織培養(yǎng)、分化、抗性篩選、檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜afp基因的克隆與序列分析

分別以提取的三種胡蘿卜基因組DNA為模板，采用afp基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物大小約1.0 kb，與預(yù)計的相符。見圖1。

M：DL2000 Marker；1：三紅胡蘿卜；2：日本胡蘿卜；3：西北胡蘿卜圖1 afp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別將三個目的片段克隆到pBM18-T Vector載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上篩選、獲得陽性重組質(zhì)粒pBM18-afp。酶切鑒定載體構(gòu)建正確。見圖2。

M：DL2000Marker；1,2:Kpn/BamHⅠ單酶切(三紅胡蘿卜)；3,4:KpnⅠ/BamHⅠ單酶切(日本胡蘿卜)；5,6:KpnⅠ/BamHⅠ單酶切(西北胡蘿卜)圖2 克隆載體pBM18-afp酶切鑒定

經(jīng)測序、序列分析表明：克隆片段全長999 bp，編碼332個氨基酸。與報道的核苷酸序列GeneBank(GI：6740789)比較，afp1(三紅胡蘿卜)、afp2(日本胡蘿卜)、afp3(西北胡蘿卜)的核苷酸序列與其同源性分別是100%、99.8%、99.9%。其中，afp2第396位堿基C→T，第771位堿基C→A，其對應(yīng)氨基酸變化為蘇氨酸→蘇氨酸，苯丙氨酸→亮氨酸；afp3第121位堿基A→T，其對應(yīng)氨基酸變化為賴氨酸→終止子。本研究選用afp1進(jìn)行載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化實驗。

2.2 afp基因甜菜葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2.1 中間載體的pSARAPT構(gòu)建

用BamHI對載體p16APT進(jìn)行酶切，回收2000 bp大小的片段(包括外源基因表達(dá)盒和aadA篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒)，與經(jīng)相同酶切、回收的同源片段載體pSAR連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得中間載體pSARAPT。見圖2-3。

P：啟動子Prrn；T：終止子TpsbA圖3 中間載體pSARAPT的結(jié)構(gòu)圖

中間載體pSARAPT酶切鑒定，構(gòu)建正確，見圖4。

M：λ/HindⅢ Marker；1：KpnI；2：HindIII；3：SpeI；4：XbaI圖4 中間載體pSARAPT的酶切鑒定

2.2.2 甜菜葉綠體表達(dá)載體pSARAfp的構(gòu)建

用KpnI酶切重組質(zhì)粒pBM18-afp，回收1000 bp片段，補(bǔ)平后與經(jīng)SmaI酶切、去磷酸化回收后的中間表達(dá)載體pSARAPT連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒 pSARAfp。見圖5。

甜菜葉綠體表達(dá)載體pSARAfp酶切鑒定圖譜如圖6所示。結(jié)果表明：載體構(gòu)建正確。

2.3 基因槍法轉(zhuǎn)化甜菜及轉(zhuǎn)基因再生植株獲得

將包埋有金粉的載體質(zhì)粒按操作規(guī)程轉(zhuǎn)化甜菜葉柄，轉(zhuǎn)化后的外植體先置于MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) (圖7A)，然后轉(zhuǎn)入含有抗生素的分化培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)分化出芽(圖7B)，繼代與抗性篩選，獲得綠色抗性再生植株(圖7C)，抗性植株在生根培養(yǎng)基中長出根系(圖7D) ，共獲得10株。

圖5 甜菜葉綠體表達(dá)載體pSARAfp結(jié)構(gòu)圖

M：λ/HindⅢ Marker；1：SpeI；2：HindⅢ；3：KpnⅠ圖6 中間載體pSARAPT的酶切鑒定

圖7 甜菜葉綠體轉(zhuǎn)化與再生植株獲得

2.4 轉(zhuǎn)基因再生植株的分子檢測

2.4.1 轉(zhuǎn)基因甜菜基因組DNA提取

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因再生植株基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖8所示?？捎糜谙乱徊降姆肿訖z測。

圖8 轉(zhuǎn)基因甜菜基因組DNA

2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的PCR檢測

以上述提取的基因組DNA為模板，以胡蘿卜基因組DNA為陽性對照，以野生型甜菜為陰性對照，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖9所示。

M：DL2000 Marker；1：陽性對照；2：陰性對照；3-6：轉(zhuǎn)基因抗性植株圖9 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

從圖中可以看出，陰性對照和6號泳道無產(chǎn)物擴(kuò)出，其余均獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為1000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相吻合。3號、4號、5號泳道對應(yīng)于1#、2#、3#抗性植株，說明三個植株為陽性。6號泳道對應(yīng)4#抗性植株，無產(chǎn)物擴(kuò)出，說明這個植株為假陽性。

3 討論

胡蘿卜屬(DaucusL.)約有60種，分布于歐洲、亞洲、非洲和美洲，我國有兩種，野胡蘿卜DaucuscarotaL.和變種胡蘿卜D.carotaL.var.sativaDC(中國科學(xué)院西北植物研究所)，該變種即我國大面積種植的栽培種。GeneBank上的胡蘿卜材料和我國的栽培鐘屬于同一種內(nèi)的不同變種(Smallwood M，1999)，兩變種長期隔離，處于不同的生態(tài)環(huán)境中。本研究考慮到我國各個地方氣候和環(huán)境差異，選用不同地域的三個主栽品種為材料，其afp基因保持了很高的種內(nèi)同源性(99.8%以上)，說明afp基因相對保守。

葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)以其安全、環(huán)保、高效表達(dá)等優(yōu)勢已經(jīng)在煙草、水稻、衣藻、苜蓿等作物中應(yīng)用，并獲得成功。我們課題組也利用植物葉綠體基因組在進(jìn)化中高度保守的特點，構(gòu)建了甜菜葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功的將抗蟲Bt基因CryIAc及抗除草劑bar基因轉(zhuǎn)化甜菜獲得轉(zhuǎn)基因再生植株及后代種子[5]。本研究就是利用自行建立的甜菜葉綠體轉(zhuǎn)化體系又一次成功的將抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)化甜菜，目的是為選育甜菜抗凍品種創(chuàng)制種質(zhì)材料，以其盡早選育出耐寒品種為生產(chǎn)服務(wù)。由于多數(shù)作物葉綠體基因組序列未知，所以目前葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用仍然僅限于較少的植物，開發(fā)新物種的轉(zhuǎn)化體系需要大量的工作[6,7]。

最近，有報道稱已經(jīng)開發(fā)了在植物之間轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因質(zhì)體的更簡單的方法。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)了質(zhì)體DNA(可能整個質(zhì)體)可以在嫁接植物的細(xì)胞之間遷移。由于可以嫁接不相容性的植物，該方法允許通過嫁接位點 (在建立嫁接接合后)將轉(zhuǎn)基因質(zhì)體轉(zhuǎn)移到不易轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞中以完成植物之間的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，這種方法可能有助于擴(kuò)大葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的物種范圍，但其適用性將限于密切相關(guān)的植物。核基因組與新質(zhì)體基因型的組合可能導(dǎo)致所謂的質(zhì)體基因組不相容性，其隨著系統(tǒng)發(fā)生距離的增加變得更可能，并且可能導(dǎo)致嚴(yán)重的突變表型。葉綠體轉(zhuǎn)化除了在作物遺傳改良上有著巨大的潛力，在植物生物反應(yīng)器的發(fā)展上也有巨大作用，可持續(xù)且高效益地生產(chǎn)生物醫(yī)藥、生物酶以及化工原材料[8]。