杜美潔，王 立，王 彬, 3△,李志強(qiáng)，閆曉鵬

(1.太原理工大學(xué)機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院，太原 030024;2.太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024; 3.College of Engineering, Design and Physical Sciences, Brunel University London, UK)

1 引 言

在基因轉(zhuǎn)移尤其是基因治療中，微注射和基因槍技術(shù)需要用物理方法穿透細(xì)胞膜[1]，所以在進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究時，若利用軟件提前對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模擬，將有助于實(shí)驗(yàn)設(shè)計以及參數(shù)設(shè)置，減少實(shí)驗(yàn)樣本的浪費(fèi)，因此需要對細(xì)胞膜力學(xué)性能尤其是破壞時的應(yīng)力應(yīng)變有所了解。原子力顯微鏡具有高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，它能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行掃描，得到細(xì)胞的表面形貌以及細(xì)胞表面某點(diǎn)的力曲線，從而獲得細(xì)胞的力學(xué)特性。Bremmell等人在活性條件下使用AFM研究了紅細(xì)胞間的相互作用力及變形，測得了細(xì)胞膜的彈性常數(shù)范圍，驗(yàn)證了細(xì)胞是粘彈性材料，其變形與彈性和粘附力有關(guān)[2]；Garcia等人利用AFM探針對活Hela細(xì)胞施加較大的力，使AFM探針穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)令膜被破壞，通過觀察力-位移曲線上明顯的突變跳躍來識別細(xì)胞膜是否破裂，得到不同高度下，細(xì)胞破膜力不同[3]；Atilla等人對分裂期和間期的Hela細(xì)胞進(jìn)行AFM實(shí)驗(yàn)，比較兩種細(xì)胞在破膜實(shí)驗(yàn)中的力-位移曲線，得到了分裂期細(xì)胞較于間期細(xì)胞，破膜力較大[4]。

國內(nèi)外學(xué)者建立了一系列細(xì)胞的有限元模型，Chizari對懸浮活細(xì)胞的微注射實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了有限元模擬，將細(xì)胞膜假設(shè)為線彈性，細(xì)胞質(zhì)假設(shè)為牛頓流體，利用流固耦合的方法得到細(xì)胞穿破時的應(yīng)變值[5]。程琴建立了一個細(xì)胞膜是線彈性、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核是粘彈性的三層復(fù)合結(jié)構(gòu)細(xì)胞模型，研究了細(xì)胞受到1PN剪切力時的應(yīng)力分布情況[6]；Unnikrishnan等人分別對肌動蛋白皮質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核設(shè)置了不同的粘性參數(shù)，研究了不同粘度對三者的力-位移曲線的影響[7]；王帶領(lǐng)通過流固耦合的方法，將細(xì)胞膜設(shè)為超彈性材料，細(xì)胞質(zhì)為水，模擬了紅細(xì)胞在光鑷?yán)爝^程中的變形情況，從而得到其剪切模量等力學(xué)參數(shù)[8]。

綜上所述，目前細(xì)胞有限元模型未考慮細(xì)胞膜破損瞬間的情況，僅對細(xì)胞彈性階段進(jìn)行了分析。據(jù)此，本研究基于原子力顯微鏡，對Hela細(xì)胞膜進(jìn)行力學(xué)性質(zhì)的研究，將實(shí)驗(yàn)與有限元模型相結(jié)合，把細(xì)胞膜假設(shè)為彈塑性材料，得到細(xì)胞膜破壞時的應(yīng)力應(yīng)變值。為今后研究細(xì)胞膜受外載時的破損條件，以及使用有限元軟件模擬AFM和微注射操作過程提供一種新方法。此外，可利用預(yù)建立細(xì)胞破損模型的方法，提前模擬基因槍實(shí)驗(yàn)過程，以便對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計與改進(jìn)，從力學(xué)角度提高實(shí)驗(yàn)命中率，增加基因?qū)爰?xì)胞的表達(dá)成功率。

2 原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

AFM(德國Bruker)，型號：Bioscope Catalyst；MLCT懸臂(德國Bruker)見圖1，F(xiàn) Triangular探針(氮化硅材料)，彈性系數(shù)為0.6 N/m；細(xì)胞培養(yǎng)控溫平臺(自制)；人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)購自ATCC，美國；低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；35 mm培養(yǎng)皿購自NEST公司。

圖1 MLCT懸臂和氮化硅探針Fig.1 MLCT cantilever and silicon nitride probe

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與樣品制備

將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和1%雙抗(青、鏈霉素)的低糖DMEM培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

取細(xì)胞間期的Hela細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，貼壁24 h后用于實(shí)驗(yàn)。在開展AFM探針壓陷實(shí)驗(yàn)時，培養(yǎng)基中加入10 mmol/L的HEPES用于保持培養(yǎng)基pH值。

2.3 實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果

將鋪有單層Hela細(xì)胞的樣本在室溫條件下固定于工作臺上，安裝F Triangular探針于探針保持架，并設(shè)置掃描頻率為1 Hz，讓針尖逼近樣品表面，設(shè)定掃描范圍為50 μm×50 μm，對細(xì)胞表面進(jìn)行掃描，選擇密度適中、較為清晰的部分，掃描Hela細(xì)胞表面形貌,見圖2。

圖2 細(xì)胞表面形貌 (a).細(xì)胞二維圖; (b).細(xì)胞三維圖Fig.2 Cell surface morphology(a).Two-dimensional cytogram;(b).Three-dimensional cytogram

實(shí)驗(yàn)利用原子力顯微鏡中的Contact模式，預(yù)先對探針的彈性系數(shù)及懸臂偏轉(zhuǎn)靈敏度進(jìn)行校正，設(shè)置針尖速度為1 μm/s，最大受力為55 nN，選擇細(xì)胞高度約為3.5 μm的隨機(jī)多組點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到探針敲擊細(xì)胞的力曲線，選擇其中在均值范圍內(nèi)較為清晰的曲線進(jìn)行分析，見圖3。藍(lán)色曲線為探針向下加載穿破細(xì)胞膜的力曲線，紅色為探針達(dá)到最大力后卸載的力曲線，二者不重合的原因是細(xì)胞具有粘附力[3]。根據(jù)加載曲線在初始接觸細(xì)胞時的彈性部分，可根據(jù)赫茲理論計算出細(xì)胞膜的表征彈性模量約為20 kPa，大于低加載力時的表面彈性模量。觀察到加載曲線有明顯突變跳躍點(diǎn)，根據(jù)Atilla等人研究結(jié)果[4]表明，探針在力曲線跳躍點(diǎn)處扎破細(xì)胞膜，此時探針距離初始接觸細(xì)胞膜前進(jìn)約2.35 μm，受力約為38.7 nN，且前期平緩，后期突變。

圖3 力-位移曲線Fig.3 Force-displacement curve

3 有限元模擬

3.1 細(xì)胞本構(gòu)模型

對Hela細(xì)胞模型作出基本假設(shè)[9-10]：

(1)實(shí)驗(yàn)位置位于細(xì)胞邊緣，所以不考慮細(xì)胞核的影響；

(2)細(xì)胞整體表現(xiàn)為粘彈性，但細(xì)胞膜相對于細(xì)胞質(zhì)而言厚度較薄，粘性可忽略不計；

Chizari[5]將細(xì)胞膜假設(shè)為線彈性，且實(shí)驗(yàn)表明探針穿破細(xì)胞膜后有不可恢復(fù)的殘余變形，即將細(xì)胞膜假設(shè)為彈塑性，細(xì)胞質(zhì)為粘彈性；

(3)細(xì)胞膜厚度均勻，不承受彎矩；

(4)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜為各向同性材料，在接觸處有連續(xù)的速度場和位移場。

細(xì)胞膜假設(shè)為彈塑性材料，彈性階段符合胡克定律，塑性階段應(yīng)用塑性非飽和模型Voce++模型[11]：

(1)

其中σs為屈服應(yīng)力，εp為塑性應(yīng)變，A、B、C、m均為需要擬合的參數(shù)。因?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)十分有限，并不能從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)中擬合到A、B、C、m四個參數(shù)，所以需要借助有限元軟件，輸入實(shí)驗(yàn)中已知數(shù)據(jù)，擬合出與實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的屈服應(yīng)力、塑性應(yīng)變等參數(shù)。

將細(xì)胞質(zhì)設(shè)為粘彈性材料，使用Maxwell粘彈性模型[12]，見圖4。

圖4 Maxwell粘彈性模型Fig.4 Maxwell viscoelastic modelF=F1+F2

(2)

k1u1=F1

(3)

k2u2=ηu2′=F2

(4)

F為外力，u1、u2分別為分力F1、F2作用下彈簧產(chǎn)生的位移，u2′為阻尼的運(yùn)動速度，k1、k2分別為彈簧的彈性系數(shù)，η為阻尼的粘性系數(shù)。

針尖即將穿破細(xì)胞膜造成局部破壞時，接觸點(diǎn)應(yīng)力超過屈服應(yīng)力，產(chǎn)生塑性變形并在短時間內(nèi)破壞，此時粘彈性細(xì)胞質(zhì)只有純彈性響應(yīng)，考慮載荷繼續(xù)作用期間細(xì)胞質(zhì)粘性影響，根據(jù)余興龍等人的研究結(jié)果[13]，將細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)簡化為彈-粘理想塑性半空間，可進(jìn)行后續(xù)計算。

3.2 模型建立

采用ABAQUS對AFM實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行有限元分析，將模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，相互驗(yàn)證，提高結(jié)論準(zhǔn)確性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)掃描得到的細(xì)胞形貌，并進(jìn)行合理簡化建立有限元模型。計算模型由基底、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及氮化硅探針?biāo)牟糠纸M成，其中基底、探針與細(xì)胞質(zhì)采用SOLID單元，細(xì)胞膜采用細(xì)化的殼單元，見圖5。

基底對實(shí)驗(yàn)和模擬的影響較小，所以假設(shè)為彈性模量較大的金屬材料(如鋼質(zhì)板，彈性模量為206 GPa，泊松比為0.3)；針尖為氮化硅材料(彈性模量為190 GPa，泊松比為0.28[12])；細(xì)胞膜采用彈塑性材料模型，利用最小誤差修正法對塑性參數(shù)以及破壞參數(shù)進(jìn)行擬合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)曲線的彈性階段測得表征模量為20 kPa，泊松比為0.3；細(xì)胞質(zhì)采用粘彈性材料模型，根據(jù)原子力顯微鏡微切削加工實(shí)驗(yàn)結(jié)果，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜模量差為(0.288±0.08) kPa[14]，泊松比為0.3，剪切松弛系數(shù)為0.6，松弛時間為25 s[15]。

圖5 三維計算模型Fig.5 3D computational model

研究中細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，所以對基質(zhì)板施加固定約束,根據(jù)實(shí)驗(yàn)對探針施加垂直細(xì)胞向下的恒定速度1 μm/s，并且當(dāng)細(xì)胞膜破壞時停止運(yùn)算。因破膜實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，故不考慮其應(yīng)變率效應(yīng)。

3.3 結(jié)果與分析

細(xì)胞膜受到探針沖擊，最大接觸力與最大位移均發(fā)生在針尖與細(xì)胞膜接觸位置，通過對實(shí)驗(yàn)曲線的分析，擬合得到了細(xì)胞膜在被穿透前塑性穿透本構(gòu)模型的屈服應(yīng)力約為7 kPa，塑性應(yīng)變?yōu)?.23。

當(dāng)細(xì)胞膜破壞時，有限元計算顯示此時接觸點(diǎn)的位移為2.32 μm，力為39.3 nN，見圖6、圖7，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，誤差范圍在1.5%左右。圖8為加載過程的細(xì)胞膜應(yīng)力云圖，隨著針尖下移，應(yīng)力逐漸增大為24.3 kPa，塑性應(yīng)變?yōu)?.23，此時細(xì)胞膜破壞。

圖6 破膜時軸向位移Fig.6 Axial displacement during membrane rupture

現(xiàn)選取細(xì)胞膜與探針接觸點(diǎn)，對其應(yīng)力與時間、應(yīng)變與時間關(guān)系進(jìn)行分析，見圖9、圖10。

圖9為細(xì)胞膜與探針接觸點(diǎn)應(yīng)力隨時間變化曲線，可以看出隨著時間增加，應(yīng)力也逐漸增加，直到細(xì)胞膜應(yīng)力增大為最大應(yīng)力24.3 kPa時，瞬時應(yīng)力變?yōu)?，此時細(xì)胞膜被探針穿透；圖10為細(xì)胞膜與探針接觸點(diǎn)等效塑性應(yīng)變隨時間變化曲線，可以看出約0.7 s時進(jìn)入塑性階段，塑性應(yīng)變隨此時接觸點(diǎn)塑性應(yīng)變保持不變。隨著時間增加而增大，直到約2.32 s時，探針位移達(dá)到2.32 μm細(xì)胞膜破壞，實(shí)驗(yàn)中探針位移為2.35 μm。

圖7 破膜時受力圖Fig.7 Force during membrane rupture

圖8 破膜過程應(yīng)力圖Fig.8 Stress of the membrane breaking process

圖9 應(yīng)力-時間曲線Fig.9 Stress-time curve

圖10 塑性應(yīng)變-時間曲線Fig.10 Plastic strain-time curve

4 結(jié)論與展望

通過原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)，得到Hela細(xì)胞破膜過程的力-位移曲線。從曲線中，不僅驗(yàn)證了細(xì)胞本質(zhì)是粘彈性材料，受力隨著針尖加載呈現(xiàn)非線性增加；而且從突變跳躍點(diǎn)得到了破膜力與破膜位移，即在細(xì)胞高度為3.5 μm處，破膜力為38.7 nN，破膜位移為2.35 μm，為未來研究細(xì)胞膜物理破壞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究將細(xì)胞膜設(shè)為彈塑性材料，細(xì)胞質(zhì)設(shè)為粘彈性材料，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與有限元模擬相結(jié)合的研究方法，擬合到了實(shí)驗(yàn)中無法得到的破壞參數(shù)，并確定了細(xì)胞膜破裂時受力為39.3 nN。驗(yàn)證了彈塑性模型可以很好地模擬Hela細(xì)胞膜破壞的整個過程，直觀地顯示細(xì)胞在受到針尖沖擊時的形貌變化，為利用有限元模擬AFM、微注射、基因槍等實(shí)驗(yàn)過程提供了有效參數(shù)。

研究中有限元模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有偏差，原因可能是：細(xì)胞骨架對細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的力學(xué)性能影響；加載速度和應(yīng)變率效應(yīng)的影響；卸載模型與加載模型不同，加載模型不能描述卸載(由于細(xì)胞具有粘附力)。將在今后的研究中進(jìn)一步進(jìn)行完善。