王艦兵 金鑫 張可明

[摘要]目的 驗(yàn)證在疫苗生產(chǎn)和醫(yī)療行業(yè)中不同種物品同載進(jìn)行脈動(dòng)真空滅菌的效果。方法 用專業(yè)溫度探頭、生物指示劑通過化學(xué)和物理方法對同載的不同物品進(jìn)行脈動(dòng)真空滅菌。首先進(jìn)行脈動(dòng)真空滅菌器空載保壓試驗(yàn)和布維-狄克（B-D）試驗(yàn)及熱穿透試驗(yàn)，確認(rèn)滅菌器性能合格后將疫苗生產(chǎn)中常用的硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等同芽孢指示劑一起按照規(guī)定的點(diǎn)位放入滅菌器內(nèi)進(jìn)行132℃、8 min挑戰(zhàn)試驗(yàn)，共3次。最后進(jìn)行生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)和無菌試驗(yàn)。結(jié)果 脈動(dòng)真空滅菌器保壓程序停止900 s后，初始壓力仍≤-93 kPa，泄露率≤2 kPa，保壓試驗(yàn)合格;在空載條件下脈動(dòng)上限+75 kPa、脈動(dòng)下限-75 kPa、滅菌溫度132℃、滅菌時(shí)間4 min，完成滅菌操作后，取出測試包并打開觀察B-D指示圖呈現(xiàn)色列條變化均勻與對照圖設(shè)計(jì)的顏色一致，滅菌器真空性能試驗(yàn)合格;在滅菌過程中的任何相同時(shí)間不同位置間的溫度差別（均一性）均≤2℃，且滅菌器溫度控制探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度差值均≤1℃，空載熱分布試驗(yàn)合格;按著規(guī)定的裝載方式且達(dá)到滿負(fù)荷裝載后選擇132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa滅菌程序進(jìn)行試驗(yàn)，所有的測試各點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間（F0）≥15 min，滿載熱穿透試驗(yàn)合格;被滅菌后的生物指示劑管內(nèi)顏色呈現(xiàn)紫色，與說明書判定合格顏色一致，為培養(yǎng)陰性（-），同時(shí)55～56℃培養(yǎng)24 h后無細(xì)菌生長，微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)合格;物品的淋洗水在接種培養(yǎng)基中放置在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，培養(yǎng)基中沒有菌落生長，無菌試驗(yàn)合格。結(jié)論 疫苗生產(chǎn)和醫(yī)療行業(yè)中常用的多種不同物品可以用脈動(dòng)真空滅菌器同時(shí)進(jìn)行132℃、8 min滅菌，且能達(dá)到國家藥典規(guī)范的要求。

[關(guān)鍵詞]脈動(dòng)真空;布維-狄克試驗(yàn);驗(yàn)證效果;微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn);無菌保證水平

[中圖分類號] R953? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）8（c）-0172-04

[Abstract] Objective To verify the effect of pulsating vacuum sterilization of different species in the vaccine manufacturing and medical industries. Methods The pulsating vacuum sterilization of different articles on the same load were carried out by chemical and physical methods with professional temperature probe and biological indicator. Firstly， no-load pressure holding test and B-D test of pulsating vacuum sterilizer and thermal penetration test were carried out to confirm that the performance of sterilizer was qualified， and then the silica gel pipes， dressing bags， rubber bolts， filters， ultrasonic crushers， glass pipettes， aseptic clothes， hemostatic forceps and other spore indicators commonly used in vaccine production were identified， challenge tests at 132℃ and 8 min were carried out in the sterilizer at the prescribed locations for three times. Finally， microbial challenge test and aseptic test were carried out. Results The initial pressure of pulsating vacuum sterilizer was still ≤-93 kPa and the leakage rate was ≤2 kPa after 900 seconds of the pressure-holding procedure of pulsating vacuum sterilizer， the pressure-holding test was qualified. Under no-load condition， the upper limit of pulsation +75 kPa， the lower limit of pulsation -75 kPa， sterilization temperature 132℃， sterilization time 4 min. After sterilization operation， the test kit was taken out and the B-D indicator chart was opened to observe that the change of Israel strip was uniform and the color of the control chart was the same， the vacuum performance test of the sterilizer was qualified. The temperature difference （homogeneity） between different locations at the same time during sterilization was less than 2℃， and the temperature difference recorded by the sterilizer temperature control probe and the monitoring recorder was less than 1℃， and the no-load heat distribution test was qualified. According to the prescribed loading mode and after full load loading， the sterilization procedure of 132℃， 8 min and pulsation±75 kPa was selected to carry out the test. The standard sterilization time （F0）≥15 min at all test points， and the full load heat penetration test was qualified. After sterilization， the color in the tube of the bio-indicator was purple， which was consistent with the qualified color determined by the instructions. It was negative for culture （-）. At the same time， there was no bacterial growth after incubation at 55-56℃ （-） for 24 hours， and the microbial challenge test was qualified. The leaching water of the product was placed in the incubator at 35℃ （-） for 3 hours， but not in the culture medium. Colony growth， sterility test was qualified. Conclusion Various kinds of different articles commonly used in vaccine production and medical industry can be sterilized simultaneously by pulsating vacuum sterilizer at 132℃ for 8 minutes， and can meet the requirements of the national pharmacopoeia.

[Key words] Pulsating vacuum; Bowie-Dick test; Verification effect; Microbial challenge test; Sterility assurance level

高壓滅菌是使物品滅菌后達(dá)到最終無菌的要求，是藥品生產(chǎn)及相關(guān)行業(yè)中的一個(gè)基本保證[1]，是控制染菌的有效措施之一[2]。被滅菌的物料及器械由于材質(zhì)、包裝、體積、耐熱系數(shù)等各不相同，同載滅菌時(shí)在相同的滅菌溫度和滅菌壓力下是否出現(xiàn)滅菌不徹底的現(xiàn)象，給生產(chǎn)和醫(yī)療帶來染菌的后果。為了保證高壓蒸汽滅菌物品的滅菌質(zhì)量[3]，根據(jù)被滅菌物品的特性采用—種或多種方法組合滅菌。滅菌后還要采取適當(dāng)方法進(jìn)行滅菌效果的驗(yàn)證[4]，高壓滅菌效果驗(yàn)證是最關(guān)鍵的步驟，同時(shí)在藥品生產(chǎn)、醫(yī)療行業(yè)發(fā)展過程中，用驗(yàn)證的方法是每個(gè)國家檢驗(yàn)質(zhì)量管理體系穩(wěn)定運(yùn)行和發(fā)展的重要手段[5]，同時(shí)也是質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）不斷發(fā)展創(chuàng)新的可靠保證。驗(yàn)證是更加安全和更加先進(jìn)的質(zhì)量保證方法[6]?，F(xiàn)在多數(shù)制藥行業(yè)已放棄了老式的下排汽高壓蒸汽滅菌器，采用了安全可靠、滅菌速度快、干燥效果好、智能程度高的脈動(dòng)真空滅菌器進(jìn)行無菌保障。本文以脈動(dòng)真空濕熱滅菌器驗(yàn)證為基礎(chǔ)，根據(jù)制藥生產(chǎn)企業(yè)和醫(yī)療單位對無菌保障的要求，開展多種不同物品同時(shí)用脈動(dòng)真空滅菌器進(jìn)行滅菌的效果驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料和試劑

滅菌對象是疫苗生產(chǎn)中常用的硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等。采用XG1.DTF-1.5B型脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），設(shè)備自帶溫度/壓力記錄儀。后安裝的SR10000型溫度曲線自動(dòng)記錄儀（日本橫河電機(jī)株式會(huì)社）。

滅菌驗(yàn)證效果所用的器材包括EB110型無線溫度記錄器（德國頤貝隆公司）;Ebro溫度驗(yàn)證記錄儀（德國頤貝隆公司）;Ebro壓力驗(yàn)證記錄儀（德國頤貝隆公司）;132℃高壓滅菌指示條和布維-狄克（B-D）真空試驗(yàn)測試圖（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）;自含菌為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（≥10-6）的脈沖指示管（美國MesalabsEZTest公司）;實(shí)驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（長春生物制品研究所有限公司，批號：20181205）;DH3600BⅡ型35℃恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2驗(yàn)證方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1滅菌器性能驗(yàn)證? 具體操作步驟如下。①真空保壓試驗(yàn)：確認(rèn)空載狀態(tài)下在滅菌器腔室內(nèi)放置1個(gè)壓力探頭，啟動(dòng)脈動(dòng)真空滅菌器保壓程序，參數(shù)設(shè)定如下。保壓限度-93 kPa，時(shí)間900 s，泄露限度≤2 kPa。結(jié)果判定，若900 s后初始壓力≤-93 kPa、泄露率≤2 kPa/15 min，則視為設(shè)備保壓合格。②B-D試驗(yàn)：滅菌器在無負(fù)載的初始狀態(tài)下將B-D測試包置放于排氣口上方20～30 cm處，并根據(jù)標(biāo)記放置。設(shè)定B-D測試參數(shù)，脈動(dòng)上下限±75 kPa，脈動(dòng)3次，滅菌溫度132℃，滅菌時(shí)間為4 min，在完成滅菌操作程序后，取出測試包并打開觀察B-D指示圖。結(jié)果判定，若B-D指示圖上的色列條變化均勻，與對照圖設(shè)計(jì)的顏色一致提示脈動(dòng)真空滅菌器能夠排除冷空氣99%以上，滅菌器真空性能合格。③空載熱分布試驗(yàn)：滅菌器在無負(fù)載的初始狀態(tài)下，將經(jīng)過校準(zhǔn)合格并處在有效期內(nèi)的14個(gè)Ebro自動(dòng)溫度、壓力監(jiān)控記錄儀，以幾何分布的方式放置在滅菌器的內(nèi)室中，保證14個(gè)監(jiān)控記錄儀的每個(gè)位置都不小于距離滅菌器內(nèi)室四壁5 cm的距離（圖1）。在輸水口處至少放置一個(gè)壓力溫度監(jiān)控儀，并設(shè)定監(jiān)控儀的讀取記錄頻次為10 s/次。同時(shí)必須保證設(shè)備和14個(gè)監(jiān)控記錄儀同時(shí)開啟和結(jié)束;選擇132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa滅菌程序進(jìn)行試驗(yàn)。滅菌操作完成后讀取并記錄每個(gè)點(diǎn)位的溫度數(shù)值。結(jié)果判定，若在滅菌過程中同一時(shí)間不同點(diǎn)位間的溫度差別（均一性）≤2℃，且滅菌器主控溫度探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度數(shù)值差值均≤1℃，提示滅菌室內(nèi)的溫度分布可確定為均勻（但是在14個(gè)溫度監(jiān)控記錄儀所監(jiān)控的點(diǎn)位也有相對的冷點(diǎn)，將其標(biāo)明，在下面的挑戰(zhàn)試驗(yàn)中密切觀察）;否則視為有“最冷點(diǎn)”并判定此次空載試驗(yàn)失敗。④滿載熱穿透試驗(yàn)：滅菌器裝載不同的待滅菌物品必須按預(yù)先設(shè)計(jì)的規(guī)定位置擺放（此后也要嚴(yán)格執(zhí)行），待達(dá)到滿負(fù)荷裝載后，將14個(gè)監(jiān)控記錄儀按空載試驗(yàn)放置同上，必須保證設(shè)備和14個(gè)監(jiān)控記錄儀同時(shí)開啟和結(jié)束。選擇132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa滅菌程序進(jìn)行試驗(yàn)。滅菌程序結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定，若所有測試點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間（F0）≥15 min，提示滅菌器在規(guī)定的裝載方式且滿載的條件下滿足滅菌要求。

1.2.2生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)驗(yàn)證? 滅菌器裝載材質(zhì)、包裝、體積、耐熱系數(shù)等各不相同的待滅菌物品時(shí)必須按預(yù)先設(shè)計(jì)的規(guī)定位置擺放（此后也要嚴(yán)格執(zhí)行），待達(dá)到滿負(fù)荷裝載后，將經(jīng)過校準(zhǔn)合格并處在有效期內(nèi)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子按著滿載熱分布試驗(yàn)所測試的每個(gè)點(diǎn)位的不同物品中放置1份生物指示劑并在滅菌器外留有一份陽性對照。按照設(shè)定的滅菌程序（132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa）進(jìn)行滅菌操作，結(jié)束后將經(jīng)過挑戰(zhàn)的生物指示劑和陽性對照同時(shí)在55～56℃下培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定，經(jīng)滅菌挑戰(zhàn)后的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子指示劑管內(nèi)顏色呈現(xiàn)紫色，（說明書給定滅菌后的合格顏色）即為培養(yǎng)陰性（-），且陽性對照管內(nèi)的生物指示劑顏色不變（黃色），可判定滅菌效果合格并達(dá)到滅菌驗(yàn)證要求同時(shí)需在質(zhì)量控制（QC）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，證明無菌生長。若被挑戰(zhàn)的生物指示劑有1支或多支指示劑的管內(nèi)培養(yǎng)液仍為黃色，則判定滅菌效果驗(yàn)證失敗。

1.2.3無菌試驗(yàn)? 在滅菌效果驗(yàn)證合格的滅菌物品中，再分別抽取硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等樣品在百級潔凈環(huán)境下由QC人員用無菌水沖洗物品并收集淋洗水。采用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)淋洗水的方法進(jìn)行檢測，在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。結(jié)果判定，所有接種培養(yǎng)基的淋洗水樣品在3次培養(yǎng)中均無菌生長，則判定無菌驗(yàn)證通過，若有1例樣品長菌則視為驗(yàn)證失敗。

2結(jié)果

2.1保壓試驗(yàn)結(jié)果

脈動(dòng)真空滅菌器保壓程序停止900 s后，初始壓力仍≤-93 kPa、泄露率≤2 kPa，保壓試驗(yàn)合格。

2.2 B-D試驗(yàn)結(jié)果

在空載條件下脈動(dòng)上限+75 kPa、脈動(dòng)下限-75 kPa、滅菌溫度132℃、滅菌時(shí)間4 min、在完成滅菌操作后，取出測試包打開觀察B-D指示圖呈現(xiàn)色列條變化均勻與對照圖設(shè)計(jì)的顏色一致，則脈動(dòng)真空滅菌器能夠排除冷空氣99%以上，滅菌器的真空性能試驗(yàn)合格。

2.3空載熱分布試驗(yàn)結(jié)果

在完成了一個(gè)滅菌周期（132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa）后讀取監(jiān)控記錄儀。數(shù)據(jù)顯示，在滅菌過程中的任何相同時(shí)間不同位置間的溫度差別（均一性）均≤2℃，且滅菌器溫度控制探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度差值均≤1℃，空載熱分布試驗(yàn)合格。

2.4滿載熱穿透試驗(yàn)結(jié)果

按著規(guī)定的裝載方式且達(dá)到滿負(fù)荷裝載后選擇132℃、8 min、脈動(dòng)±75 kPa滅菌程序進(jìn)行試驗(yàn)。滅菌程序結(jié)束后讀取監(jiān)控記錄儀數(shù)據(jù)顯示，所有的測試點(diǎn)F0≥15 min，滿載熱穿透試驗(yàn)合格。

2.5微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

芽孢指示劑按著滿載熱分布試驗(yàn)所測試的每個(gè)點(diǎn)位的不同物品中布放，完成1個(gè)滅菌程序操作后，取出所有被挑戰(zhàn)的生物指示劑觀察顏色并同陽性一起在55～56℃下培養(yǎng)24 h。被滅菌后的生物指示劑管內(nèi)顏色呈現(xiàn)紫色，與說明書判定合格顏色一致，為培養(yǎng)陰性（-），同時(shí)55～56℃培養(yǎng)24 h后無細(xì)菌生長，微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)合格。

2.6無菌試驗(yàn)結(jié)果

硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等物品的淋洗水在接種培養(yǎng)基中放置在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，培養(yǎng)基中沒有菌落生長，無菌試驗(yàn)合格。

3討論

本試驗(yàn)首先通過了滅菌器的性能驗(yàn)證、微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)驗(yàn)證和無菌試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)合蒸汽滅菌的三大基本要素，即作用時(shí)間、滅菌溫度和飽和蒸汽的質(zhì)量[7]，總結(jié)以上所有試驗(yàn)結(jié)果提示脈動(dòng)真空滅菌器在選擇132℃、8 min滅菌程序的條件下多種不同物品同載進(jìn)行脈動(dòng)真空滅菌驗(yàn)證合格，且符合現(xiàn)行GMP關(guān)于對滅菌法的要求。同時(shí)不僅證明了本臺(tái)脈動(dòng)真空滅菌器設(shè)備本身的可靠性，關(guān)鍵是對滅菌程序進(jìn)行了驗(yàn)證，保證了滅菌效果的有效性[8]。同時(shí)密切觀察在最冷點(diǎn)放置的生物指示劑是否通過微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)從而進(jìn)一步證明滅菌的效果[9]。目前我國部分制藥企業(yè)和醫(yī)療單位仍沿用121℃、30 min;121℃、15 min以及116℃、40 min的程序進(jìn)行滅菌[10]，存在滅菌品種單一、升溫緩慢、滅菌時(shí)間相對較長、干燥效果不理想等情況。本研究根據(jù)制藥企業(yè)和醫(yī)療行業(yè)中對滅菌物品多樣化的具體特點(diǎn)進(jìn)行分析，采用了多種物品同時(shí)用脈動(dòng)真空滅菌器（對于非液體類的）進(jìn)行132℃、8 min滅菌程序試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，不僅安全性能得到保障，而且滅菌時(shí)間短、滅菌效果可靠、干燥效果好[11]，可以在制藥企業(yè)和及醫(yī)療行業(yè)中推廣應(yīng)用。

單一品種物品的滅菌無論從滅菌過程還是滅菌程序的驗(yàn)證都相對容易和簡單，但實(shí)際工作情況并非如此，大多數(shù)行業(yè)都是不同物品同時(shí)進(jìn)行滅菌，這樣就要求必須要嚴(yán)格按著驗(yàn)證過程中的包裝方式和裝載位置進(jìn)行包裝和裝載。以保證滅菌的有效性和均一性[12]。如果包裝方式和裝載位置發(fā)生改變必須重新做滅菌效果驗(yàn)證。如果遇到透氣效果不好、耐熱系數(shù)高的被滅菌物品可采用提高滅菌溫度和延長滅菌時(shí)間的方法來解決，但無論采用何種滅菌參數(shù)，都必須驗(yàn)證所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施。在日常的工作過程中能確保物品滅菌后的無菌保證水平（SAL）≤10-6。驗(yàn)證及操作人員應(yīng)具備極強(qiáng)的責(zé)任心和專業(yè)理論水平[13]。

綜上所述，滅菌效果驗(yàn)證是藥品生產(chǎn)企業(yè)和醫(yī)療行業(yè)中質(zhì)量安全的必要條件和保障，設(shè)備的驗(yàn)證和裝載方法的驗(yàn)證要定期化和常態(tài)化并且符合設(shè)備驗(yàn)證的工藝要求[14]，驗(yàn)證后在日常生產(chǎn)中的每次滅菌也必須對各項(xiàng)參數(shù)和Fo值進(jìn)行監(jiān)測[15]。也是對藥品生產(chǎn)質(zhì)量和醫(yī)療工作的重要保障。

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（收稿日期：2019-01-31? 本文編輯：劉克明）