馬建蘋/王 丹/李善家/郭 濤 蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州730050

馬建蘋/王 丹/郭 濤 甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，蘭州理工大學，蘭州730050

晉 玲 甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州730000

藿香(Agastache rugosa)為唇形科(Labiatie)藿香屬(Agastache)一年生或多年生草本植物，全草可入藥，有止嘔吐、治霍亂腹痛、驅(qū)逐腸胃充氣、清暑等效；果可作香料；葉及莖均富含揮發(fā)性芳香油，有濃郁的香味，為芳香油原料[1]。藿香揮發(fā)油中的主要成分甲基胡椒酚也能夠?qū)Χ喾N病原菌產(chǎn)生抑制作用[2]。隨著植物內(nèi)生真菌被人們重視，其次級代謝產(chǎn)物中許多具有抗菌活性的單體化合物被報道[3]。植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的物質(zhì)，因此希望從藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物獲得具有抗菌活性的物質(zhì)代替化學合成的抗菌劑。但國內(nèi)外鮮有藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性的報道。鑒于藿香及其內(nèi)生真菌的重要價值，本研究希望對藿香內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物進行抑菌活性研究，篩選出能產(chǎn)生抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的菌株，為具有抗菌活性的單體化合物的分離提供活性指導，同時為藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用提供理論基礎。

1.材料及儀器

1.1 材料與儀器

植物采集于甘肅省蘭州市石佛溝，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學晉玲教授鑒定為藿香Agastache rugosa。紫外分光光度計、電子分析天平、電熱恒溫干燥箱、超凈工作臺、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、實驗型高壓滅菌鍋等均為常用儀器；實驗所用藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 供試菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均由蘭州理工大學生命科學與工程學院實驗中心提供。

2.實驗方法

2.1 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：取去皮馬鈴薯200g，加適量水煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃滅菌30 min，待冷卻后分別加入100U/mL的青霉素和硫酸鏈霉素各1mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200g，煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，然后加入1.5 % ～ 2 %瓊脂，121℃滅菌30 min，待冷卻至50℃左右時，加入100U/mL的青霉素和硫酸鏈霉素各1mL。

MH肉湯：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，牛肉膏0.3%，加蒸餾水并加熱使其充分溶解后，用1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2 ～ 7.4，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，101 kPa，121℃滅菌30 min，放入4℃冰箱，備用。

2.2 內(nèi)生真菌的分離與鑒定

組織分離法：取干燥洗凈的藿香花，用解剖刀將其切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊。在無菌條件下先后用75 % (V/V)乙醇(1 min)、0.1 %升汞(2 min)消毒，消毒后用無菌水反復沖洗3次，用已滅菌的濾紙吸干水分。用已滅菌的鑷子將組織塊接入到PDA培養(yǎng)基上，以最后1次表面消毒沖洗后的無菌水作為參照，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。待內(nèi)生真菌長出后，觀察菌落形態(tài)特征，重復劃線純化[4]。采用插片法：將已純化的內(nèi)生真菌接種到PDA平板上，將已滅菌的蓋玻片斜插入平板中，28℃培養(yǎng)，生長完全后放于載玻片上經(jīng)過棉蘭染色后，在光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子和分生孢子梗等形態(tài)。根據(jù)《真菌鑒定手冊》初步鑒定[5]。對次級代謝產(chǎn)物具有良好抗菌活性的菌株H-2與H-9進行測序后，將序列在NCBI中BLAST分析對比得出菌株H-2黑孢霉屬(Niqrospora sp.)真菌，其登錄號為MK894846，菌株H-9為鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌，其登錄號為MK880492。

2.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)及供試樣品的制備

挑取已活化的菌株接種于PDB培養(yǎng)液中，28℃、120r/min培養(yǎng)7d，發(fā)酵結(jié)束后，抽濾，得到濾液與菌絲體。在濾液中先后加入等體積的乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，各萃取3次，合并萃取液，減壓蒸干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇部位；菌絲體冷凍干燥后用乙醇回流提取2～3h，提取液減壓蒸干得菌絲體的乙醇部位；發(fā)酵液減壓蒸干得到發(fā)酵液的水部位。

2.4 MlC值測定

精確稱量待測樣品6.0 mg，加入150 μL的DMSO充分溶解，再加入1350μL的MH肉湯，將樣品濃度稀釋為2000，1000，500，250，125μg/mL，備用。在96孔平底微孔板中依次加入100μL的MH肉湯，50μL梯度稀釋的樣品溶液，50μL 0.5麥氏濃度的菌液，使待測樣品的終濃度分別為1000，500，250，125，62.5，31.25μg/mL[ - ]。 陰性對照組為50μL1% DMSO的MH肉湯，陽性對照為50μL含50 μg/mL硫酸鏈霉素的MH肉湯。37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12-18 h，然后每孔加入50 μL 100μg/mL INT（碘硝基四唑紫）顯色劑，30min后觀察顏色變化，以沒有顯示紅色的最低濃度作為該樣品對某一細菌的最小抑制濃度(MIC)。

3.結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定

從藿香的花中共分離出13株內(nèi)生真菌，根據(jù)其顯微形態(tài)特征鑒定出其中菌株H-1為絲核菌屬(Agonomyaetcssp.)，菌株H-3為長蠕孢菌屬(Helminthosporium sp.)，菌株H-4、H-12及H-8為短蠕孢菌屬(Brachysporium sp.)，菌株H-5、H-6和H-7為絲孢菌屬(Hyphomycetessp.)、菌株H-9為鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、菌株H-11為鐮刀菌屬(Fusarium sp.)，菌株H-13為頭孢霉屬(Trichosporeaesp.)，菌株H-10未鑒定出結(jié)果。

3.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物各部位抗菌活性

本實驗采用微量肉湯稀釋法對藿香花中內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物進行抑菌活性測定，陽性對照硫酸鏈霉素在50 μg/mL時對所有供試菌都有抑制活性，陰性對照組樣品均顯紅色，表明抑菌試驗模型良好，有抑菌活性的樣品結(jié)果見表1，菌株H-2的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，對6種供試細菌的MIC值均為250μg/mL；菌株H-9的乙酸乙酯部位對無乳鏈球菌的抑制作用很強，在31.25 μg/mL具有抑制作用，對其他供試細菌在500 μg/mL也具有抑制作用。次級代謝產(chǎn)物的正丁醇部位抑菌活性較好的為H-2、H-5、H-6和H-9，均能夠在最大濃度1000 μg/mL時對這六種供試細菌表現(xiàn)出抑制作用，菌株H-4的正丁醇部位在濃度為1000 μg/mL時除了對金黃色葡萄球菌無抑制活性，對其他5種供試細菌均能夠產(chǎn)生抑制作用。H-2的菌絲體的乙醇提取物在最大濃度1000 μg/mL對這六種供試細菌表現(xiàn)出抑制作用。13株內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物的水部位在最大濃度1000 μg/mL時對這六種供試細菌都沒有表現(xiàn)出抑制作用。綜上所述，藿香花中內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位與正丁醇部位對六種供試菌具有抑制作用，且乙酸乙酯部位的抑制作用較強。

表1 藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的最低抑菌濃度(MlC,μg/mL)

4.討論

通過查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，藿香中內(nèi)生真菌的種類與其次級代謝產(chǎn)物的生物活性的研究還未見報道，而與藿香同科不同屬的植物廣藿香的中的內(nèi)生真菌被大量研究。廣藿香中的優(yōu)勢菌株為擬莖點霉屬、鐮刀菌屬等，同時也發(fā)現(xiàn)有彎孢屬、黑孢霉屬及曲霉屬真菌的存在。可以發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬、黑孢霉屬真菌是兩種植物共同所都有的內(nèi)生真菌。目前，我國常用的抑菌效果的評估方法主要是牛津杯法與濾紙片法，通過抑菌圈的大小來判斷抑菌效果的強弱，此類方法難以進行大量樣品的活性篩選，且抑菌物質(zhì)的濃度低時可能無抑菌圈[ ]。因此，具有簡便性和良好的方法學性能的微量肉湯稀釋法測定MIC值，更適合檢測大量樣品的抗菌活性及臨床藥敏性試驗。目前，國內(nèi)外微量肉湯稀釋法僅用于臨床藥敏試驗與植物化學成分的抗菌活性的測定，而對植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的體外抗菌活性測定沒有在相關文獻中報道。采用微量肉湯稀釋法可以快速準確篩選出具有良好抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的極性部位，從而為后續(xù)具有抗菌活性的單體化合物的分離純化提供活性導向。藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗菌活性還未被報道出來，本實驗通過測定藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的體外抗菌活性，篩選出能夠產(chǎn)生良好抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的菌株，為利用發(fā)酵技術從藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物中生產(chǎn)抗菌劑及甘肅本地產(chǎn)藿香的開發(fā)利用提供了理論指導。