王 玎，白 雪

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

土壤真菌，屬于陸生真菌，是以土壤為生存場(chǎng)所，完成全部或部分生活史的真菌。土壤真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物種類多樣，結(jié)構(gòu)新穎，具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒等生物活性，是新藥以及新的先導(dǎo)化合物的重要物質(zhì)來源[1-2]。從云南大圍山土壤樣品中分離得到一株真菌HU35P-2，并通過體外抗腫瘤試驗(yàn)確定其具有較好的生物活性，依據(jù)菌落形態(tài)特征及ITS rDNA測(cè)序分析方法鑒定為Tolypocladium sp.HU35P-2，為尋找新藥的先導(dǎo)化合物，對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)成分進(jìn)行分離和研究，得到4個(gè)化合物，根據(jù)其理化性質(zhì)并綜合運(yùn)用波普技術(shù)，鑒定這4個(gè)化合物分別為格鏈孢酚（alternariol，1）、β-adenosine（2）、ergosterol（3）、β-胡蘿卜苷（4）。其中，化合物1 為首次從彎頸霉屬中分離得到。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SPD-10A紫外檢測(cè)器；Bruker-ARX-400 型核磁共振儀；Bruker AV-600 型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；Shimadzu LC-10ATvp 型分析型高效液相色譜儀；Shimadzu LC-8A 型制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；薄層色譜硅膠和柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；Sephedex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech公司）。

1.2 試藥

分析純甲醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，正丁醇，丙酮（廣州化學(xué)試劑廠）；色譜純甲醇，乙腈；氘代試劑（美國(guó)CIL公司）。

2 提取分離

將大米培養(yǎng)基搗碎后，加入等體積的95 %乙醇，超聲40 min浸泡，提取液減壓濃縮后放置通風(fēng)處揮發(fā)。用等體積的乙酸乙酯，正丁醇各萃取3次，濃縮提取液，得26 g乙酸乙酯萃取物，17 g正丁醇萃取物，乙酸乙酯層萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100:0→0:100）梯度洗脫，得到3個(gè)餾分，經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜（氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫）、Sephadex LH-20柱色譜（甲醇-水系統(tǒng)洗脫）、制備HPLC（乙腈-水、甲醇-水系統(tǒng)洗脫）進(jìn)行分離純化，得到化合物1～4（見圖1）。

圖1 化合物1～4結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇），紫外254 nm下明顯暗斑。1H-NMR（400 MHz， DMSO-d6）譜中δH11.8（1H，s，OH-3）為一活波氫信號(hào)；4個(gè)芳香氫質(zhì)子信號(hào)δH6.36（1H，d，J=1.7 Hz，H-4），6.63（1H，d，J=2.3 Hz，H-3’），6.71（1H， d，J=2.3 Hz，H-5’），7.24（1H，d，J=1.7 Hz），δH2.70（3H，s，H-7’）為一甲基質(zhì)子信號(hào)。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中δC164.0（C-7）顯示有一個(gè)酯羰基碳信號(hào)，δC164.7（C-5），165.4（C-3），158.4（C-4’），152.6（C-2’），138.3（C-6’），138.1（C-1），117.5（C-5’），108.9（C-1’），104.3（C-6），101.6（C-3’），100.9（C-4），97.4（C-2）為苯環(huán)上芳香碳信號(hào)，提示含有兩個(gè)間位取代苯環(huán)片段，δC25.2 （C-7’）為甲基碳信號(hào)。綜合以上信息，結(jié)合文獻(xiàn)[3]，鑒定該化合物1為alternariol；化合物1碳?xì)湫盘?hào)歸屬見表1。

表1 化合物1的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)（DMSO-d6）

化合物2：白色粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）譜中，特征性氫質(zhì)子信號(hào)δH8.36（1H，s，H-8），8.14（1H，s，H-2），7.36（2H，s， NH2-6），結(jié)合13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）譜中，δC156.1（C-2），152.4（C-6），149.1（C-4），139.9（C-8），119.3（C-5），推測(cè)存在腺嘌呤結(jié)構(gòu)；δH5.88（1H，d，J=6.3 Hz，H-1’），4.61（1H，dd，J=11.4，6.3 Hz，H-2’），4.14（1H，m， H-3’），3.96（1H，m，H-4’），3.67（1H，m，H-5’b），3.55（1H，m，H-5’a）和δC88.0（C-1’），86.0（C-4’），73.6（C-2’），70.8（C-3’），61.8（C-5’）信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在核糖結(jié)構(gòu)。綜合以上數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)[4]，確定化合物2為腺嘌呤核苷。

化合物3：無色結(jié)晶（二氯甲烷）。紫外254 nm下顯示明顯暗斑，10 %硫酸乙醇溶液（v/v）顯色呈現(xiàn)墨綠色。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）給出6個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δH1.04（3H，d，J=6.6 Hz），0.95（3H，s），0.92（3H，d，J=6.8 Hz），0.84（3H，d，J=6.3 Hz），0.82（3H，d，J=6.5 Hz），0.63（3H，s）推測(cè)該化合物為甾體類。此外氫譜中δH5.20（2H，dd，J=15.2，6.9 Hz）為側(cè)鏈C-22，23位反式雙鍵的特征氫信號(hào)，δH5.57（1H，dd，J=5.4，2.6 Hz），5.38（1H，dt，J=5.4，2.6 Hz）為烯氫信號(hào)。δH3.63（1H，m）為3位連氧的特征氫信號(hào)。以上氫數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)[5]對(duì)比一致，確定該化合物3結(jié)構(gòu)為ergosterol。

化合物4：無色結(jié)晶（甲醇），紫外254 nm下顯示明顯暗斑，10 %硫酸乙醇溶液（v/v）顯色呈現(xiàn)深墨綠色。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）給出6個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δH1.0（3H，d，J=6.2 Hz），0.95（3H，s），0.89（3H，t，J=6.6 Hz），0.81（3H，d，J=6.8 Hz），0.79（3H，d，J=6.8 Hz），0.65（3H，s）推測(cè)該化合物為甾體類。此外氫譜中δH5.34 （1H，br s，H-6）為C-6雙鍵氫信號(hào)；δH4.87 （1H，d，J=5.0 Hz，H-1’），4.42（1H，m，H-6’a），4.20（1H，m，H-3’），3.64（1H，m，H-5’）和3.46～2.86（m，葡萄糖中H）及結(jié)合13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）譜中，δC101.2，77.4，77.2，73.9，70.5和61.5提示含有葡萄糖片段。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中，δc 140.9，121.6，77.1，56.6，55.8，50.0，45.6，42.3，38.7，37.2，36.6，35.9，33.8，32.9，31.9，31.8，29.6，29.1，28.2，25.8，24.2，23.0，20.0，19.9，19.5，19.4，19.0，12.2，12.1證實(shí)化合物為甾體類；結(jié)合文獻(xiàn)[6]，鑒定化合物4為β-胡蘿卜苷。