張孟麗 張衛(wèi)明 束成杰

摘要：為了比較羅布紅麻（Apocynum venetum L.）花、種子、葉中的金絲桃苷含量差異，采用回流提取法提取羅布紅麻花、種子及葉中的金絲桃苷，利用高效液相層析法（HPLC）測(cè)定3器官中金絲桃苷的含量。結(jié)果表明，金絲桃苷濃度在0.01～0.10 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998 1;花、種子、葉中金絲桃苷的得率分別為0.085%、0.012%、0.052%。

關(guān)鍵詞：羅布紅麻（Apocynum venetum L.）;金絲桃苷;高效液相層析法;含量;比較

中圖分類號(hào)：R282.71? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）17-0066-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.017? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To compare the hyperoside in flowers， seeds and leaves of Apocynum venetum， the hyperoside extracted by reflux extractions， and content was determined by HPLC assay. The results showed that within the range of 0.01to 0.10 mg/mL， hyperoside showed a good linear correlation with peak area， and the coefficient was 0.998 1. The hyperoside yield in the flowers， leaves and seeds were 0.085%， 0.012%， 0.052%.

Key words： Apocynum venetum L.; hyperoside; HPLC; content; comparion

羅布紅麻（Apocynum venetum L.）為羅布麻屬夾竹桃科多年生宿根草本植物，含乳汁[1]，具有很強(qiáng)的抗逆性[2]。羅布麻在3月下旬至4月中旬萌芽，5月下旬至6月中旬進(jìn)入花初期，8月下旬至9月中旬進(jìn)入花末期，花期通常持續(xù)90 d左右，之后種子進(jìn)入成熟期，年生長(zhǎng)大約180 d[3]。

研究表明，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、紫云英苷、槲皮素、山萘酚是羅布麻中主要的化學(xué)成分[4，5]。其中，金絲桃苷具有抗急性肝損傷、抗抑郁、抗炎癥、抗血栓、抗癌、抗菌、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等藥理作用[6-9]。但對(duì)羅布紅麻的研究開發(fā)大多集中于葉片。本試驗(yàn)利用液相色譜法測(cè)定新疆羅布紅麻花、種子、葉片金絲桃苷的含量，旨在為羅布紅麻的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

材料：羅布紅麻（產(chǎn)地新疆阿勒泰），南京野生植物綜合利用研究院提供。

儀器：NH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市三壇儀器廠;SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;KF-1209電子天平，凱豐集團(tuán)有限公司;液相色譜儀1200 系列，美國(guó)Agilent公司;微孔濾膜，上海嘉鵬科技有限公司。

試劑：金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher Scientific公司;磷酸（優(yōu)級(jí)純）、乙腈（優(yōu)級(jí)純）、乙醇（分析純）、甲醇（分析純），均購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 金絲桃苷提取? 用乙醇作為提取劑，采用回流提取法提取金絲桃苷。將羅布紅麻花、種子、葉除雜干燥，粉碎，各稱取粉末50 g，分別加入8倍體積的80%乙醇在80 ℃下回流提取3次，1 h/次，合并提取液，離心后過濾，放至室溫，減壓回收溶劑，收集濾液，微膜過濾，得3份樣品液[10，11]。

1.2.2? 色譜條件? 流動(dòng)相為乙腈-0.25%磷酸，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm[12-14]。

1.2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線? 準(zhǔn)確稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋成濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09、0.10 mg/mL的溶液，分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，得線性關(guān)系良好的回歸方程。

1.2.4? 樣品測(cè)定? 3份樣品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花、種子及葉中金絲桃苷含量，3次重復(fù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 12.0軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

從圖1可以看出，金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品在12～14 min出現(xiàn)單一的顯著峰。將上述金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度分別進(jìn)樣，得峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。計(jì)算得知，金絲桃苷的峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）呈線性關(guān)系，回歸方程為y=29.051x-86.807，R2=0.998 1，說明金絲桃苷進(jìn)樣濃度在0.01～0.10 mg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。將新疆羅布紅麻花、種子、葉樣品分別進(jìn)行高效液相色譜分析，得各樣品的峰面積，色譜結(jié)果如圖3所示，與金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，確認(rèn)花、種子、葉中的金絲桃苷的出峰時(shí)間及峰面積。

2.2? 儀器的精密度

為評(píng)價(jià)儀器的精密度，需測(cè)定花、種子、葉樣品液中金絲桃苷的峰面積，計(jì)算金絲桃苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。分別取花、種子、葉樣品液，精密吸取20 μL，按“1.2.2”色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定花、種子、葉樣品液中金絲桃苷的峰面積，計(jì)算金絲桃苷含量的RSD。結(jié)果顯示，花、種子、葉中金絲桃苷含量的RSD分別為2.9%、2.5%、1.9%（n=6），表明儀器精密度良好[15-17]。

2.3? 供試溶液的穩(wěn)定性

為評(píng)價(jià)供試品溶液的穩(wěn)定性，按“1.2.2”色譜條件，分別取花、種子、葉樣品液20 μL，在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測(cè)定各樣品溶液中金絲桃苷的峰面積，計(jì)算金絲桃苷含量的RSD。結(jié)果顯示，花、種子、葉中金絲桃苷含量的RSD分別為1.6%、1.1%、1.4%（n=6），表明花、種子、葉樣品液在配制24 h內(nèi)穩(wěn)定[18]。

2.4? 方法重復(fù)性

取花、種子、葉樣品液各3份進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算金絲桃苷含量的RSD，以評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，花、種子、葉中金絲桃苷含量的RSD分別為1.86%、0.20%、0.61%（n=3），表明該方法的重復(fù)性滿足要求[19，20]。

2.5? 回收率

分別取羅布紅麻花、種子、葉樣品液各1 mL，加入對(duì)照品，制備供試品溶液，并在相同色譜條件下進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率及RSD，結(jié)果如表1所示。由表1可知，花、種子、葉中金絲桃苷平均加樣回收率分別為102.00%、98.40%、94.00%（n=6），RSD分別為3.28%、1.60%、1.10%（n=6），表明羅布紅麻花、種子、葉樣品液中金絲桃苷含量穩(wěn)定[21]。

2.6? 新疆羅布紅麻花、種子、葉各部位金絲桃苷含量比較

根據(jù)金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，由峰面積計(jì)算得出羅布紅麻花、種子、葉濃度，再結(jié)合提取液體積，計(jì)算得出各自含量，結(jié)果如表2所示。由表2可知，花、種子、葉中金絲桃苷的平均得率分別為0.085%、0.012%、0.052%，3個(gè)部位中金絲桃苷的含量分布為花>葉>種子。

3? 討論

目前，羅布紅麻產(chǎn)品多集中于對(duì)葉的開發(fā)利用，本試驗(yàn)對(duì)羅布紅麻花、種子、葉3個(gè)器官的金絲桃苷含量進(jìn)行比較分析，采用回流提取法提取羅布紅麻花、種子及葉中的金絲桃苷，利用高效液相層析法測(cè)定3器官中金絲桃苷的含量。結(jié)果顯示，新疆羅布紅麻花、種子、葉中金絲桃苷的得率分別為0.085%、0.012%、0.052%，其中葉中金絲桃苷與蘆丁含量與石秋梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)的新疆產(chǎn)羅布紅麻中蘆丁和金絲桃苷含量結(jié)果基本一致。新疆羅布紅麻不同器官中金絲桃苷的含量為花>葉>種子，該結(jié)果可為羅布紅麻的開發(fā)及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 肖正春，張衛(wèi)明.我國(guó)古代對(duì)羅布麻的稱謂及研究考[J].中國(guó)野生植物資源，2016，35（3）：55-57.

[2] 揭雨成，冷? 鵑，許? 英.羅布麻生態(tài)特征與產(chǎn)業(yè)化研究進(jìn)展[J].中國(guó)麻業(yè)，2001，23（3）：34-37.

[3] 王東清，李國(guó)旗，程? 志.羅布麻研究利用現(xiàn)狀及展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：310-313.

[4] ZHOU J，SUN J B，XU X Y，et al.Application of mixed cloud point extraction for the analysis of six flavonoids in Apocynum venetum leaf samples by high performance liquid chromatography[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2015， 107：273-279.

[5] AN H，WANG H，LAN Y，et al. Simultaneous qualitative and quantitative analysis of phenolic acidsand flavonoids for the quality control of Apocynum venetum L. leaves by HPLC-DAD-ESI-IT-TOF-MS and HPLC-DAD[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2013，85：295-304.

[6] 孫時(shí)華，姜榮華，祝海燕，等.金絲桃苷體外抗胃癌作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（9）：979-983.

[7] 李錦松，陳劍鴻，孟民杰.金絲桃苷藥理作用及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31（2）：269-272.

[8] 林? 萍，易宏偉，張? 斐.金絲桃苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥， 2012，14（10）：23-26.

[9] SHORT R A，TUTTLE K R. Clinical evidence for the influence of uric acid on hypertension，cardiovascular disease，and kidney disease：A statistical modeling perspective[J].Seminars in nephrology，2005，25（1）：25-31.

[10] DONG L C，ZHOU X H，LI D H，et al. Extraction of hyperoside from Hypericum perforatum L. using ctab reversed micelles[J].Chinese journal of chemistry，2009，87（4）：584-590.

[11] 衛(wèi)星星，王轉(zhuǎn)花.高效液相色譜法測(cè)定苦蕎籽殼中蘆丁和槲皮素的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（12）：1909-1910.

[12] 侯秋苑，馮白茹，申? 茹，等.菟絲子中金絲桃苷的提取工藝優(yōu)選[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，30（3）：141-142，159.

[13] 高? 雷，張? 平，程? 鋼.正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃蜀葵花中金絲桃苷的提取工藝[J].中國(guó)藥師，2009，12（3）：354-356.

[14] 尤? 潔.槐米中蘆丁的提取條件研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016， 12（13）：43-44.

[15] 洪? 軍，胡曉穩(wěn)，王? 佩，等.槐米中蘆丁的提取及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2015（15）：16-18.

[16] YAO Y P，TIAN C R，CAO W. Anti-oxidative constituents of ethanol extract from buckwheat seeds by HPLC-Electro-Spray MS[J].Agricultural sciences in China，2008，7（3）：356-362.

[17] 黃克南，周江煜.金蓮花不同植株部位的金絲桃苷含量比較[J].廣西中醫(yī)藥，2014，37（3）：68-71.

[18] 莊向平.虞杏英銀杏葉中黃酮含量的測(cè)定和提取方法[J].中草藥，1992，23（3）：122-124.

[19] 李卓恒，孟德勝，盧來春，等.RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量[J].中國(guó)藥房，2012，23（43）：4082-4083.

[20] 石秋梅，鄧翻云，吳敏言.HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆產(chǎn)2種羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷及異槲皮苷的量[J].中草藥，2014，45（9）：1326-1329.

[21] NAKASHIMA H，KIDO Y，KOBAYASHI N，et al. Antiretroviral activity in a marine redalga：Reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract of Schizymenia pacifica[J].Journal of cancer research and clinical oncology，1987，113（5）：413-416.