朱文東

摘要：Hippo通路與昆蟲的生長、發(fā)育和變態(tài)等過程密切相關，在動物不同物種之間高度保守。scalloped基因是Hippo通路元件Yki的偶聯(lián)因子之一，參與調控基因的表達?？寺×艘吧ＰQ（Bombyx mandarina）scalloped基因的完整開放閱讀框（ORF）及其上下游的部分非編碼序列。序列聯(lián)配分析表明，與家蠶相比，野桑蠶scalloped基因序列存在多處的核酸片段缺失、插入及位點差異。結構域分析表明，野桑蠶Scalloped蛋白與家蠶、黑腹果蠅、小鼠和人的蛋白結構類似，均含有完整的TEAD蛋白家族典型TEA結構域和PDB結構域，但野桑蠶編碼蛋白缺失蛋白C末端序列。系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明，昆蟲Scalloped蛋白與脊椎動物TEF3可能存在共同的起源;家蠶Scalloped在進化中出現(xiàn)晚于野桑蠶且經(jīng)歷較多遺傳選擇過程。

關鍵詞：野桑蠶（Bombyx mandarina）;Hippo通路;scalloped基因

中圖分類號：Q785? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0123-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.033? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Hippo pathway is closely related to the physiological and biochemical processes of insect growth， metamorphosis and development， and highly conserved among different species. Scalloped is one of terminal action factor of Hippo pathway， which regulates the expression of a large number of genes. In this study， the complete ORF and partial UTR sequence of scalloped in wild silkworm （Bombyx mandarina） were cloned. Indels and variable sites were discovered after sequences analysis between Bombyx mori and Bombyx mandarina. The domain structure analysis shown that the encoding protein of scalloped in wild silkworm， domestic silkworm， fruit fly， mice and human have the similar domain architecture， while partial of the C-terminal of wild silkworm scalloped protein absent. The phylogenetic analysis showed that the Scalloped in insects and TEF3 in vertebrate could have a common origin， and the Scalloped of domestic silkworm could be appeared later than that in wild silkworm， and experienced more genetic selection process.

Key words： wild silkworm（Bombyx mandarina）; Hippo pathway; scalloped gene

Hippo通路是最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一條細胞信號轉導途徑[1]，也是一條極為保守的信號通路，在昆蟲生長和發(fā)育過程中起著十分重要的作用[2，3]。果蠅Hippo通路核心部分是由Hpo（Hippo）、Wts（Warts）、Sav（Salvador）、Mats（Mob as tumor suppressor）和Yki（Yorkie）組成的，Yki（Yorkie）是該通路的末端作用因子。Hippo通路通過調控Yki的輔轉錄調控作用，起到控制細胞生長和形態(tài)發(fā)生等作用。該通路不同組分的功能缺陷均可導致果蠅胚胎、復眼、翅成蟲盤等器官組織過生長，甚至產(chǎn)生致死作用[2-5]。。哺乳動物Hippo通路由相應的同源物MST1/2、hSAV1、LATS1/2、MOB1構成[6-8]。果蠅Hippo通路核心激酶級聯(lián)反應首先是在上游信號輸入因子的作用下，Hpo-Sav復合體磷酸化，并依次磷酸化Wts-Mats復合物而激活，活化后的Wts-Mats復合物促使Yki磷酸化并與14-3-3蛋白結合，抑制Yki的促增殖和抗凋亡活性，促使細胞凋亡[7，9]。如果Hippo通路被阻斷或失活，Yki不能被磷酸化，則Yki可遷移進入細胞核，并與一系列轉錄因子結合，促進下游靶基因的表達，最終啟動Hippo通路的促增殖和抗凋亡作用[10]。在眾多轉錄因子中，TEAD同源蛋白是該通路末端作用因子YAP在細胞核內的主要偶聯(lián)蛋白之一[11，12]。YAP與TEAD的相互作用在不同物種之間表現(xiàn)出極高的保守性。果蠅Yki與Sd蛋白作用，哺乳動物YAP與Sd同源物TEF/TEAD蛋白相互作用，Sd/TEAD提供DNA結合活性，可以促進非磷酸化的YAP核定位。Hippo通路的功能響應最終有賴于YAP和TEAD蛋白在細胞核內的偶聯(lián)并與靶基因識別位點的結合[8，9]。TEAD在果蠅中的同源蛋白被命名為Scalloped。研究發(fā)現(xiàn)scalloped基因的功能受到破壞后可導致果蠅形態(tài)產(chǎn)生嚴重異常。

在哺乳動物中，TEAD家族蛋白在胚胎發(fā)育、營養(yǎng)代謝、壓力應答等事件中起到重要作用[9，13-16]。研究還發(fā)現(xiàn)，TEAD還與乳腺癌、輸卵管腫瘤、胃腸腫瘤等密切相關。抑制TEAD-YAP活性可以控制癌癥的發(fā)生發(fā)展[11]。因此，TEAD蛋白作為一種腫瘤標志物的同時，也是腫瘤靶向治療的潛在位點之一。

野桑蠶（Bombyx mandarina）是家蠶（Bombyx mori）的馴化祖先[17，18]。長期的人工馴化使得家蠶和野桑蠶在體形、器官尺寸、發(fā)育模式等方面均表現(xiàn)出顯著差異。目前，已有20余個家蠶Hippo通路成員基因獲得克隆和鑒定[19，20]。鑒于Hippo通路在動物生長發(fā)育中的重要作用，在野桑蠶中開展對scalloped的研究將有助于深入研究馴化作用對桑蠶體形及器官影響的分子機制，同時還為桑蠶生產(chǎn)性能改良、農(nóng)林害蟲防控提供可利用的分子靶標。本試驗依據(jù)scalloped基因的保守和同源性，克隆了野桑蠶scalloped基因開放閱讀框（ORF）及部分上下游非翻譯區(qū)（UTR）序列，通過生物信息學方法分析野桑蠶scalloped編碼基因的序列特征，為深入研究Hippo通路與野桑蠶變態(tài)發(fā)育提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 供試昆蟲

所使用的昆蟲為野桑蠶材料1份，由陜西省蠶桑重點實驗室提供。

1.2? 野桑蠶總RNA的抽提和cDNA第一鏈的合成

利用Trizol試劑（Invitrogen）抽提5齡第三天的野桑蠶總RNA，超微量分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo）檢測RNA質量和濃度是否合格，使用M-MLV反轉錄試劑盒（Invertrogen）并按照試劑盒使用說明書反轉錄并合成cDNA。

1.3? 基因克隆和測序

根據(jù)家蠶scalloped基因序列（XM_004927964.1）設計引物，p1：5′-TCTTTGTGCCATTCTTCGCAT-3′，5′-TCTTTTGAAGTGATATGATGTCC-3′;p2：5′-CAA

TTTTGGCAGCCAGGCCTACA-3′，5′-ATAGCTATAG

AATCATAAGGC-3′。

以野桑蠶cDNA作為模板，克隆scalloped基因全長。PCR條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 100 s，26次循環(huán);72℃ 10 min，結束反應。PCR產(chǎn)物采用1.20%（m/V）的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的片段，TA克隆后測序。測序結果使用Lasergene軟件包下的SeqMan子程序去除接頭污染，之后進行序列拼接，組裝成單一序列。

1.4? 信息學分析

從CNBI數(shù)據(jù)庫獲取家蠶及其他物種的scalloped同源基因的核酸和蛋白序列;利用MUSLE軟件包進行核苷酸、氨基酸序列的同源性比對和相似性分析;采用MEGA6.0軟件以鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1 000，Poisson model，pairwise deletion）;利用ExPASY（http：//wed.expasy.org/compute_pi）、SMART（http：//small.embl-heidelberg.de/）、PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）等在線工具分析蛋白理化性質、序列特征、保守基序、二級結構特征和開放閱讀框。

2? 結果與分析

2.1? PCR擴增和凝膠電泳檢測

抽提野桑蠶RNA后，反轉錄合成cDNA。利用管家基因actin3對cDNA進行檢測，結果表明在500～750 bp出現(xiàn)單一清晰的目的條帶（圖1A），表明反轉錄成功，合成的cDNA可以用于后續(xù)試驗。利用設計的2對野桑蠶scalloped基因特異性引物（p1、p2），以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，電泳檢測結果顯示2對引物可擴增獲得明亮、單一的條帶（圖1B）。將p1、p2擴增獲得的凝膠條帶切膠、回收，提取擴增產(chǎn)物并轉入載體中，進行TA克隆，最后抽提單一菌落的載體質粒進行測序分析。

2.2? 野桑蠶scalloped基因克隆和測序

經(jīng)克隆測序和序列拼接后，獲得一段長度為1 555 bp的核酸序列。將獲得的核酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast檢索，結果與昆蟲scalloped基因及哺乳動物TEAD基因具有較高同源性，其中與家蠶scalloped基因序列比對覆蓋度為82%，匹配序列的相似性為99%。ORF框預測結果表明，野桑蠶scalloped基因ORF長度為1 074 bp，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA，ORF編碼357個氨基酸殘基，編碼蛋白預測分子質量為40.2 ku，等電點為4.72（圖2）。結果表明，試驗擴增所得的序列為野桑蠶scalloped基因，并成功克隆得到該基因的ORF編碼序列及其上下游的部分非翻譯區(qū)（UTR）。

2.3? 序列特征分析

將克隆得到的野桑蠶scalloped基因與家蠶同源核酸序列進行比對。結果（圖2）表明，兩者在多個位點及片段上存在差異。與家蠶相比，這些差異包括野桑蠶scalloped基因在5′端UTR序列存在一處長度為48 bp的序列插入，在ORF內存在多處序列插入或缺失，以及在多個位點上出現(xiàn)堿基替換。蛋白序列比對（圖3）表明，相比于家蠶，野桑蠶scalloped基因編碼蛋白顯著變短，其主要差異位點在于蛋白C端和141～176 aa位點之間出現(xiàn)氨基酸殘基的缺失，同時在282～283 aa位點之間出現(xiàn)48個氨基酸殘基的插入。暗示該基因伴隨桑蠶的馴化過程出現(xiàn)顯著的序列變異。

二級結構分析（圖4）表明，野桑蠶Scalloped蛋白在N端（1～86 aa區(qū)域）存在3處α螺旋和1處β折疊，在N端（204～357 aa）存在1處α螺旋和6處β折疊，而在兩區(qū)域之間是一段較長的無規(guī)卷曲結構，與TEA結構域和PDB結構域在該蛋白上的分布相吻合，表明TEA結構域主要由α螺旋構成，PDB結構域主要由β折疊及無規(guī)卷曲結構組成。

結構域分析（圖5）表明，野桑蠶Scalloped蛋白與家蠶（Bombyx mori）、黑腹果蠅（Drosophila

melanogaster）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo

sapiens）的蛋白結構類似，均含有完整的TEAD蛋白家族典型TEA結構域和PDB結構域，但野桑蠶缺失Scalloped的同源蛋白C端序列。野桑蠶與其他物種在TEA結構域和PDB結構域相應蛋白序列上具有高度的相似性，但在兩結構域之間的連接區(qū)域與果蠅、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等存在一定程度的區(qū)別，且與家蠶存在明顯差異。暗示野桑蠶Scalloped蛋白在與家蠶等具有類似功能的同時，可能還存在其他生物學功能，或存在行使功能過程的差異性。

2.4? 系統(tǒng)發(fā)生樹分析

為了進一步分析scalloped基因編碼蛋白親緣關系，利用赤擬谷盜、家蠶、黑腹果蠅等昆蟲及人、小鼠、斑馬魚（Danio rerio）等脊椎動物的同源蛋白序列構建了系統(tǒng)進化樹（圖6）。脊椎動物中存在4種Scalloped蛋白的同源蛋白（TEF1、TEF3、TEF4和TEF5），但物種之間存在數(shù)量差異，如在斑馬魚中未獲得TEF3和TEF4同源蛋白，表明scalloped在脊椎動物中可能存在功能上的多樣性。TEF1、TEF4和TEF5各自構成亞群，同時三者可聚類共同構建成一個大支。昆蟲中僅存在一種Scalloped同源蛋白，且與脊椎動物中的TEF3聚為一大類群，其中脊椎動物TEF3又單獨聚為亞群，暗示TEF3與昆蟲Scalloped蛋白親緣關系更為接近，可能存在共同的起源，在進化過程中出現(xiàn)分化。野桑蠶同家蠶聚為一個亞群，其中家蠶支長顯著長于野桑蠶，表明該基因在家蠶進化過程中經(jīng)歷較長的進化選擇事件。

3? 小結與結論

Hippo信號通路是一條極為保守的信號轉導途徑，參與對胚胎、器官、組織發(fā)生等過程的調控，與昆蟲生長發(fā)育、變態(tài)發(fā)育、生殖、營養(yǎng)代謝等許多生理生化過程密切相關。有關Hippo通路在桑蠶中的研究較少，野桑蠶中尚未見相關的研究報道。因此，考察Hippo通路組成元件在家蠶和野桑蠶之間的差異，可以為桑蠶發(fā)育性狀差異研究提供理論基礎。

scalloped基因編碼蛋白是Hippo通路的主要終端作用因子，調控了大量發(fā)育密切關聯(lián)基因的表達。本研究克隆了野桑蠶scalloped基因的完整ORF及其上下游的非編碼序列，序列分析表明野桑蠶scalloped基因編碼蛋白與昆蟲及哺乳動物同源蛋白具有高度相似性，與家蠶相比存在多處的核酸片段缺失和插入及位點差異，暗示野桑蠶scalloped基因在可能存在類似的調控功能的同時，還可能存在其他作用及功能行使方式。

系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明，脊椎動物之間存在Scalloped同源蛋白數(shù)量差異，可能與基因功能分化有關;昆蟲Scalloped蛋白與脊椎動物TEF3可能存在共同的起源;家蠶Scalloped在進化中出現(xiàn)晚于野桑蠶且經(jīng)歷較多遺傳選擇過程，可能與家蠶起源于野桑蠶且經(jīng)過快速的人工選擇有關。

本研究通過對野桑蠶Hippo通路末端效應元件scalloped基因進行克隆和分析，有利于深入研究桑蠶Hippo通路的作用機理，為深入開展家蠶、野桑蠶的性狀差異分析及相關功能基因發(fā)掘提供理論基礎。

參考文獻：

[1] BADOUEL C，GARG A，MCNEILL H. Herding Hippos：Regulating growth in flies and man[J].Current opinion in cell biology，2009，21（6）：837-843.

[2] PANTALACCI S，TAPON N，LEOPOLD P. The Salvador partner Hippo promotes apoptosis and cell-cycle exit in Drosophila[J]. Nat Cell Biol，2003，5（10）：921-927.

[3] UDAN R S，KANGO-SINGH M，NOLO R，et al. Hippo promotes proliferation arrest and apoptosis in the Salvador/Warts pathway[J].Nat Cell Biol，2003，5（10）：914-920.

[4] XU T，WANG W，ZHANG S，et al. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics：The Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase[J].Development，1995，121（4）：1053-1063.

[5] HARVEY K F，PFLEGER C M，HARIHARAN I K.The Drosophila Mst ortholog， hippo，restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis[J].Cell，2003，114（4）：457-467.

[6] WU S，HUANG J，DONG J，et al. hippo encodes a Ste-20 family protein kinase that restricts cell proliferation and promotes apoptosis in conjunction with salvador and warts[J].Cell，2003， 114（4）：445-456.

[7] KANGO-SINGH M，NOLO R，TAO C，et al. Shar-pei mediates cell proliferation arrest during imaginal disc growth in Drosophila[J].Development，2002，129（24）：5719-5730.

[8] TAPON N，HARVEY KF，BELL D W，et al. salvador promotes both cell cycle exit and apoptosis in Drosophila and is mutated in human cancer cell lines[J].Cell，2002，110（4）：467-478.

[9] ZHANG L. Control of growth and beyond：A special issue on Hippo signaling[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2015， 47（1）：1.

[10] DONG J，F(xiàn)ELDMANN G，HUANG J，et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and Mammals[J].Cell，2007，130（6）：1120-1133.

[11] ZHOU Y，HUANG T，CHENG A S，et al. The TEAD family and its oncogenic role in promoting tumorigenesis[J].International journal of molecular sciences，2016，17（2）：138.

[12] LAMAR J M，STERN P，LIU H，et al. The Hippo pathway target，YAP，promotes metastasis through its TEAD-interaction domain[J].Proceedings of the national academy of sciences，2012，109（37）：E2441-E2450.

[13] YIN M X，ZHANG L. Hippo signaling in epithelial stem cells[J].Acta biochimica biophysica sinica，2015，47（1）：39-45.

[14] SHI P，F(xiàn)ENG J，CHEN C. Hippo pathway in mammary gland development and breast cancer[J].Acta biochimica biophysica sinica，2015，47（1）：53-59.

[15] MO J S，MENG Z，KIM Y C，et al. Cellular energy stress induces AMPK-mediated regulation of YAP and the Hippo pathway[J].Nature cell biology，2015，17（4）：500-510.

[16] MAO B，GAO Y，BAI Y，et al. Hippo signaling in stress response and homeostasis maintenance[J].Acta biochimica biophysica sinica，2015，47（1）：2-9.

[17] XIANG H，LIU X，LI M，et al. The evolutionary road from wild moth to domestic silkworm[J].Nature ecology & evolution，2018，2（8）：1268-1279.

[18] XIA Q，GUO Y，ZHANG Z，et al. Complete resequencing of 40 genomes reveals domestication events and genes in silkworm（Bombyx）[J].Science，2009，326（5951）：433-436.

[19] XU X，BI H L，ZHANG Z J，et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm，Bombyx mori[J].Insect science，2018，25（6）：1006-1016.

[20] ZENG W，LIU R，ZHANG T，et al. BmYki is transcribed into four functional splicing isoforms in the silk glands of the silkworm Bombyx mori[J].Gene，2017，646：39-46.