林志雄 魚(yú)海瓊 王瑩 翟建新 張利

摘要：通過(guò)比對(duì)NCBI上馬流感H3N8序列，針對(duì)HA和NA基因序列高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性強(qiáng)的引物與探針，優(yōu)化了程序，建立了以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)馬流感H3N8的方法。結(jié)果表明，該方法最小檢測(cè)濃度為3.36×102 copies/μL;特異性強(qiáng)，僅針對(duì)馬流感H3N8樣本檢出為陽(yáng)性;對(duì)58份臨床樣本的檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為12.07%，是常規(guī)PCR的2.3倍，且與病毒分離100%符合。

關(guān)鍵詞：馬流感病毒;H3N8亞型;實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：Q789;S852.65? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）17-0129-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.034? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： By comparing the H3N8 sequence of Equine influenza virus （EIV） from NCBI， highly specific primers and probes were designed for the highly conserved region of HA and NA gene sequences， and the program was optimized to establish a RT-PCR method for the detection of EIV H3N8. The results showed that the minimum detection concentration was 3.36×102 copies/μL. With high specificity， only EIV H3N8 samples were positive. The positive detection rate of 58 clinical samples was 12.07%， 2.3 times that of conventional PCR， and 100% consistent with virus isolation.

Key words： Equine influenza virus（EIV）; H3N8 subtype; RT-PCR

馬流感病毒（Equine influenza virus，EIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，其基因組由8股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，包括神經(jīng)氨酸酶（HA）基因、血凝素（NA）基因、核蛋白（NP）基因、基質(zhì)蛋白（M）基因、聚合酶堿性蛋白1（PB1）基因、聚合酶堿性蛋白2（PB2）基因、聚合酶酸性蛋白（PA）基因和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）基因[1]，其中HA基因與NA基因在流感中變異最為頻繁，亞型眾多。到目前為止，馬流感僅有H7N7和H3N8兩種亞型[1]。

H3N8亞型流感是馬屬動(dòng)物呼吸道疫病的主要原因，發(fā)病率高，致死率較低，但常造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，馬流感亦極有可能與其他流感發(fā)生重組。目前臨床上檢測(cè)馬流感的方法較多，有病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)，基于血清學(xué)的ELISA，也有基于核酸檢測(cè)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，相比之下核酸擴(kuò)增的效率更高，實(shí)時(shí)熒光定量的方法由于綜合性能強(qiáng)，檢測(cè)速度快，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，使用便利，并已得到大量廣泛的使用[2]。為此，本研究針對(duì)馬流感H3N8 HA和NA基因序列高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性強(qiáng)的引物與探針，擬建立以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)馬流感H3N8的方法，以期為后續(xù)產(chǎn)品商品化提供理論和研究基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

禽流感H5N1、H5N6、H7N9各5份，人流感H3N2、 H1N1各5份，馬流感H3N8 5份，臨床采集到馬鼻咽喉拭子共58份。由于試驗(yàn)所用的病毒株涉及保存條件要求和樣本信息保密性，故病毒株測(cè)試試驗(yàn)主要在廣東省疾病預(yù)防控制中心和深圳市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室完成;臨床樣本測(cè)試試驗(yàn)在深圳市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室完成。

儀器和試劑：7500型熒光PCR儀購(gòu)自ABI公司，探針引物由Takara合成，pMD 18-T載體購(gòu)自Takara，熒光PCR試劑購(gòu)自美國(guó)VitaNavi公司。

1.2? 方法

1.2.1? 引物設(shè)計(jì)? 從NCBI上下載馬源宿主H3N8亞型流感HA和NA基因序列，分離地點(diǎn)包括中國(guó)、日本、中國(guó)香港、印度等地。應(yīng)用Lasergene軟件分別比對(duì)HA和NA基因序列的保守區(qū)域和SNP特性，使用在線網(wǎng)站weblogo3對(duì)引物及探針進(jìn)行特殊結(jié)構(gòu)分析，NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)最終確定引物及探針。所設(shè)計(jì)出的H3N8引物探針特異性檢測(cè)馬流感H3N8亞型，而對(duì)其他亞型無(wú)檢出。本研究中所確定的馬流感H3N8引物探針序列信息見(jiàn)表1。

1.2.2? 陽(yáng)性質(zhì)粒制備? 通過(guò)比對(duì)馬流感H3N8序列，選擇含有HA和NA基因序列區(qū)域合成質(zhì)粒片段，并將該片段與pMD 18-T載體相連接轉(zhuǎn)化至工程菌大腸桿菌DH5α中，通過(guò)氨芐藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，通過(guò)PCR以及酶切測(cè)序鑒定目的片段，合格后抽提質(zhì)粒制備陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3? 熒光PCR擴(kuò)增? 反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Omnitaq PCR buffer 12.5 μL，35 mmol/L dUTPs 0.5 μL，Enzyme Combo LA 2 μL，Cesium Taq LA DNA Polymerase 1 μL，H3上游 primer（400 nmol/L） 0.1 μL，H3下游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8上游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8下游primer（400 nmol/L）0.1 μL，核酸5 μL和ddH2O 3.6 μL。