卜春艷, 王 穎, 王 微, 范永周, 郭戰(zhàn)坤

(保定市婦幼保健院1婦產(chǎn)科， 2內(nèi)科， 3醫(yī)教科， 河北 保定 071000)

子癇前期(preeclampsia, PE)是一種病因的異質(zhì)性疾病，其主要特征為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致終末器官損傷。雖然子癇前期病情在分娩前仍可保持輕微，但也可能迅速演變?yōu)閲?yán)重的器官或全身并發(fā)癥，如嚴(yán)重的高血壓、蛋白尿和以溶血、肝酶升高、血小板減少等為主要特征的HELLP綜合征,直接威脅孕婦和胎兒健康[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期作為全球孕產(chǎn)婦死亡第三大原因，大約影響2%～8%的妊娠，有超過三分之一的嚴(yán)重產(chǎn)科疾病與子癇前期密切相關(guān)[3-4]。近些年，人們發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥與子癇前期密切相關(guān)，補(bǔ)充葉酸可影響機(jī)體同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)代謝[5-6]。此外，機(jī)體葉酸代謝關(guān)鍵酶5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因的突變可以影響機(jī)體葉酸和Hcy的代謝，進(jìn)而影響子癇前期的發(fā)病[7]。故本研究旨在評(píng)估孕期補(bǔ)充葉酸和MTHFR基因多態(tài)性分析與子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為子癇前期早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和預(yù)防提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料篩選2017年6月-2018年5月于保定市婦幼保健院產(chǎn)科檢查經(jīng)子宮動(dòng)脈多普勒波分析判定為子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)的初產(chǎn)孕婦215例。采用隨機(jī)抽樣的方式將215例受試者隨機(jī)分為干預(yù)組A、干預(yù)組B和對(duì)照組，各組分別為72例、72例和71例。干預(yù)組A孕婦年齡為22～31歲，平均年齡(27.8±6.1)歲；干預(yù)組B孕婦年齡為21～31歲，平均年齡(28.5±6.3)歲；對(duì)照組孕婦年齡為22～30歲，平均年齡(28.2±5.9)歲。各組受試者在年齡、肥胖(BMI>30 kg/m2)、糖尿病、H型高血壓(伴有高同型半胱氨酸血癥的原發(fā)性高血壓)例數(shù)、血壓[收縮壓(SBP)、無(wú)創(chuàng)測(cè)量血壓(NBP)]、血生化[低密度脂蛋白(LDL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、同型半胱氨酸(Hcy)]等方面無(wú)明顯差異(P>0.05)，均衡可比。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮動(dòng)脈多普勒分析判定為子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)；(2)有以下風(fēng)險(xiǎn)因素之一者：慢性高血壓、孕前糖尿病、肥胖；(3)初次妊娠；(4)孕期為22～24周；(5)對(duì)本次研究均知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)多胎妊娠者；(2)已接受其他預(yù)防性治療者；(3)對(duì)葉酸過敏者；(4)既往有抑郁病史者。

1.2 干預(yù)方法干預(yù)組A(72例)孕婦每日服用0.8 mg葉酸(0.4 mg/片，江西制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H36020872)，2次/日。干預(yù)組B(72例)孕婦每日服用同一品牌葉酸0.4 mg，1次/日。對(duì)照組口服片劑相同的酵母片。

1.3 子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)入組后受試者出現(xiàn)SBP≥140 mmHg或NBP≥90 mmHg并伴有蛋白尿(即尿蛋白≥0.3 g/24 h)則被判定為子癇前期。如果SBP≥160 mmHg或者NBP≥110 mmHg，生化指標(biāo)和血常規(guī)指標(biāo)異常，并出現(xiàn)明顯的子癇前期癥狀，則被評(píng)定為重度子癇前期，否則判定為輕度。本研究入組子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)根據(jù)子宮動(dòng)脈多普勒波參數(shù)預(yù)測(cè)，所有疾病診斷均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的主治以上醫(yī)師判定，減少診斷信息偏倚。

1.4 MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)入組次日采集受試者空腹靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中。用基因組DNA提取試劑盒[由天根生化科技(北京)有限公司提供]提取孕婦全血中DNA，設(shè)計(jì)PCR引物如下：上游引物：5′-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3′；下游引物：5′-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3′。擴(kuò)增DNA中C677T位點(diǎn)的198 bp基因片段。設(shè)置PCR擴(kuò)增程序：95℃，5 min；95℃，30 s；65℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min；32個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物用Hinf I核酸內(nèi)切酶酶切3 h。將酶切產(chǎn)物行DNA凝膠電泳，并根據(jù)電泳結(jié)果中DNA片段大小判定基因型類型和等位基因分布：野生型CC為一個(gè)198 bp的片段；純合TT為175 bp和23 bp兩個(gè)片段；突變雜合型CT為23 bp、175 bp和198 bp三個(gè)片段。T等位基因頻數(shù)=TT頻數(shù)×2+CT頻數(shù)；C等位基因頻數(shù)=CC頻數(shù)×2+CT頻數(shù)。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢查同“1.4”收集受試者靜脈血，離心取上清，Hcy和葉酸采用通過電化學(xué)發(fā)光試劑盒測(cè)定，LDL、TC、TG指標(biāo)由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)組和對(duì)照組受試者基線特征比較干預(yù)組A、干預(yù)組B和對(duì)照組受試者年齡、肥胖例數(shù)、糖尿病例數(shù)、H型高血壓例數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血壓(SBP、NBP)、血生化(LDL、TC、TG、Hcy)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 干預(yù)組和對(duì)照組受試者基線特征比較

2.2 干預(yù)組和對(duì)照組子癇前期發(fā)病情況干預(yù)組A、干預(yù)組B和對(duì)照組受試者的子癇前期發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組的子癇前期發(fā)病率最高，為56.3%，明顯高于干預(yù)組A(33.3%)和干預(yù)組B(31.9%)，干預(yù)組A和干預(yù)組B的子癇前期發(fā)病率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組輕度子癇前期的發(fā)病率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組重度子癇前期的發(fā)病率顯著高于干預(yù)組A和干預(yù)組B(P<0.05)，見表2。

對(duì)干預(yù)組和對(duì)照組子癇前期并發(fā)癥的發(fā)生情況進(jìn)行分析，顯示3組均有胎兒生長(zhǎng)受限和羊水過少發(fā)生，但3組的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組出現(xiàn)2例胎盤早剝，但發(fā)生率較低，見表3。

表2 干預(yù)組和對(duì)照組子癇前期發(fā)病情況/例(%)

表3 干預(yù)組和對(duì)照組子癇前期并發(fā)癥的發(fā)生情況/例(%)

2.3 PE組和正常組C677T位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較根據(jù)子癇前期發(fā)生與否將所有受試者分為2組：子癇前期(PE)組和正常組。PE組根據(jù)嚴(yán)重程度不同又可分為輕度和重度。子癇前期組孕婦TT 基因型和T677 等位基因頻率分別為34.5%和58.6%，顯著高于正常組孕婦的14.1%和31.6%(P<0.05)。CC 基因型和C677 等位基因頻率分別為17.2%和41.4%，顯著低于正常組的50.8%和68.4%(P<0.05)。子癇前期組CT基因型與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同嚴(yán)重程度的子癇前期孕婦中，輕度子癇前期和重度子癇前期的基因型頻率分布和等位基因分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

2.4 PE組和正常組不同基因型孕婦血清中Hcy代謝指標(biāo)的含量比較子癇前期組孕婦血清Hcy含量均顯著高于正常組(P<0.05)。不同基因型的比較發(fā)現(xiàn)，TT基因型的子癇前期孕婦Hcy顯著高于CT基因型和CC基因型的子癇前期孕婦(P<0.05)，但CT基因型和CC基因型的子癇前期孕婦血清中Hcy含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。正常組不同基因型的Hcy含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表4 PE組和正常組C677T位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較/例(%)

子癇前期組孕婦血清葉酸含量均顯著低于正常組(P<0.05)。在子癇前期組內(nèi)部，TT基因型、CT基因型和CC基因型葉酸含量逐步遞升，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在正常組內(nèi)部，CC基因型葉酸含量顯著高于TT基因型和CT基因型(P<0.05)，TT基因型和CT基因型間無(wú)明顯差異(P>0.05)，見表5。

表5 PE組和正常組不同基因型孕婦血清中Hcy代謝指標(biāo)的含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05； 與TT基因型比較，#P<0.05； 與CC基因型比較，△P<0.05。

3 討論

子癇前期(PE)是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒患病和死亡的主要原因之一，子癇前期死亡占孕產(chǎn)婦總死亡的16%，是妊娠相關(guān)性死亡的第三大病因[8]。子癇前期孕婦發(fā)生胎盤早剝，血小板減少，彌散性血管內(nèi)凝血，肺水腫和吸入性肺炎的風(fēng)險(xiǎn)增加3～25倍，而且有PE病史的女性心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，如何預(yù)測(cè)和預(yù)防子癇前期則變得尤為重要。

近年來(lái)，隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，子宮動(dòng)脈多普勒波分析在預(yù)測(cè)子癇前期中的價(jià)值逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。在正常妊娠中，孕婦子宮動(dòng)脈助力隨著孕齡的增加而降低，而PE孕婦的子宮動(dòng)脈血流阻力會(huì)隨著孕齡的增加而增加[9]。因此，可以通過子宮動(dòng)脈多普勒檢查間接檢查子宮胎盤灌注的充分性，從而預(yù)測(cè)孕婦子癇前期風(fēng)險(xiǎn)[10]。本研究參考了張弘雎等[11]提出的子宮動(dòng)脈阻力評(píng)分法，將總阻力分值>3分的孕婦判定為子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)者[12]，根據(jù)受試者意愿自覺選擇入組與否。本研究中，對(duì)照組71例未經(jīng)任何干預(yù)預(yù)防的孕婦，子癇前期發(fā)病率高達(dá)56.3%，明顯高于人群3.9%的發(fā)病率[8]，再次印證了子宮動(dòng)脈多普勒波分析在預(yù)測(cè)孕婦子癇前期風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值。

子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡釋，但更多的研究認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷是其發(fā)生的重要因素，而血漿高Hcy水平可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷直接或間接相關(guān)。MTHFR是葉酸代謝通路的關(guān)鍵酶，具有催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，還原下來(lái)的甲基可參與Hcy的甲基化。MTHFR有C和T兩個(gè)等位基因，野生型CC可突變?yōu)橥蛔冃蚑T和雜合型CT，突變后的MTHFR基因穩(wěn)定性和活性均發(fā)生變化，從而使Hcy的代謝發(fā)生變化引起高Hcy血癥。Hcy是甲硫氨酸代謝循環(huán)中的副產(chǎn)物，S腺苷半胱氨酸脫腺苷為同型半胱氨酸(Hcy)，Hcy再經(jīng)N5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶脫甲基生成甲硫氨酸。而葉酸和Vit B12是N5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的重要輔助因子，其含量對(duì)Hcy代謝有著重要的影響。因此，研究MTHFR基因型和孕期補(bǔ)充葉酸與子癇前期的相關(guān)性對(duì)于科學(xué)預(yù)測(cè)和預(yù)防子癇前期有著重要的價(jià)值。

本研究通過子宮動(dòng)脈多普勒分析篩選子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，用高、低劑量(0.8 mg和0.4 mg)葉酸給予干預(yù)。結(jié)果顯示，孕期補(bǔ)充葉酸的干預(yù)組A和干預(yù)組B子癇前期發(fā)病率和重度子癇前期發(fā)病率均較未補(bǔ)充葉酸的對(duì)照組顯著降低，而對(duì)輕度子癇前期發(fā)病率影響不大。值得注意的是，補(bǔ)充高劑量葉酸的干預(yù)組A的重度子癇前期發(fā)病率(9.7%)明顯低于低劑量組(16.7%)。說(shuō)明補(bǔ)充葉酸可以有效預(yù)防子癇前期的發(fā)病率，且高劑量葉酸補(bǔ)充對(duì)于降低重度子癇前期發(fā)病率有較好預(yù)防作用，此結(jié)果與郭方等[13]、毛寶宏等[14]及Wen等[15]的結(jié)果一致，但與Li等[16]的結(jié)果不一致。此外，3組子癇前期并發(fā)癥發(fā)生率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與研究組樣本量較少有關(guān)，還需要更大樣本的研究探究葉酸補(bǔ)充對(duì)子癇前期并發(fā)癥的影響。

根據(jù)子癇前期發(fā)病與否，本研究將所有受試者重新分組，分為子癇前期組和正常組，分析其基因型與發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果顯示，TT基因型、CT基因型和T等位基因在子癇前期組中出現(xiàn)比例更高，而正常組中CC基因型和C等位基因出現(xiàn)比例較高。隨后，分析不同基因型患者的血清Hcy和葉酸指標(biāo)，結(jié)果顯示，子癇前期組孕婦血清Hcy含量均顯著高于正常組(P<0.05)。而子癇前期組內(nèi)，TT基因型的子癇前期孕婦Hcy顯著高于CT基因型和CC基因型的子癇前期孕婦(P<0.05)。子癇前期組孕婦血清葉酸含量均顯著低于正常組(P<0.05)。在子癇前期組內(nèi)，TT基因型、CT基因型和CC基因型葉酸含量逐步遞升，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同的是，葉酸水平與發(fā)病與否呈負(fù)相關(guān)。因此，可以推斷，TT基因型和T等位基因可能通過影響血漿Hcy水平而影響子癇前期的發(fā)生，TT基因型孕婦具有更高的子癇前期風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，子癇前期嚴(yán)重危害妊娠期母嬰健康，MTHFR基因C677T多態(tài)性和補(bǔ)充葉酸與子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有一定相關(guān)性，在子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中進(jìn)行MTHFR基因C677T多態(tài)性分析，及時(shí)補(bǔ)充葉酸，有助于預(yù)防子癇前期發(fā)生。