宋曉環(huán) 姚曉媛 王忠超 胡金秋 朱莉

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130031)

阿爾茨海默病(AD)是從階段性記憶障礙到全面性認(rèn)知障礙的一種神經(jīng)變性疾病，同時(shí)也是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性病變，多在中老年人發(fā)病，因此又稱為老年性癡呆〔1～3〕。目前對(duì)AD的延緩和控制尚無(wú)理想方案。研究表明〔4,5〕，姜黃素對(duì)β樣淀粉蛋白(Aβ)的神經(jīng)毒性作用已得到證實(shí)，因此姜黃素對(duì)AD的潛在治療作用日益受到關(guān)注，其作用機(jī)制研究成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬分析姜黃素如何調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和海馬區(qū)記憶蛋白海馬區(qū)突觸前蛋白(Synapsin)1、海馬區(qū)突觸后蛋白(PSD)-95的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度及mRNA水平，從而達(dá)到提高AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以發(fā)揮防治AD的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，選取雙轉(zhuǎn)基因雄性淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1小鼠30只，體質(zhì)量(24.2±1.4)g，隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組，每組10只；用同月齡、同體系野生雄性C57BL/6小鼠10只作為空白對(duì)照組，體質(zhì)量(23.8±1.3)g；4組均給予正常飲食。

1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備 Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；Leica2245切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Biotek公司，美國(guó))；Biometra PCR擴(kuò)增儀(Biotek公司，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)主要試劑 姜黃素由上海遠(yuǎn)慕生物科技公司提供；鹽酸多奈哌齊由安理申衛(wèi)材藥業(yè)有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字H20070181)；鼠抗β-catenin和GSK-3β抗體購(gòu)于Abcam公司；鼠抗海馬區(qū)Synapsin1、海馬區(qū)PSD-95抗體購(gòu)于武漢三鷹公司；SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司； Trizol購(gòu)于Invitrogen公司；Taq酶、DL2000 marker和實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。

1.4給藥方法 4組給藥方式均為灌胃，空白對(duì)照組和模型組每天一次給予生理鹽水(0.1 ml/10 g)、鹽酸多奈哌齊組每天一次給予鹽酸多奈哌齊(3.25 mg/kg)、姜黃素組每天一次給予姜黃素(50 mg/kg)，給藥時(shí)間為8 w。

1.5各組學(xué)習(xí)記憶能力 進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)〔6〕，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d，水迷宮連續(xù)訓(xùn)練4 d，第5天測(cè)試小鼠逃避潛伏期、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間。

1.6各組甲醛溶液腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度 治療8 w結(jié)束后，處死小鼠并取腦組織海馬區(qū)，放入甲醛溶液固定后常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，制備5 μm切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，通過(guò)OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度。

1.7免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腦組織海馬區(qū)β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽(yáng)性表達(dá) 制備3 μm石蠟切片4張，分別進(jìn)行4種抗體的免疫組織化學(xué)染色(SP法)，觀察β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色、細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。通過(guò)Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件半定量分析蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，分析結(jié)果以光密度值(OD值)表示，OD值越大陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.8RT-PCR檢測(cè)各組腦組織海馬區(qū)β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平 用Trizol提取腦組織海馬區(qū)總RNA，所有樣本基因擴(kuò)增3次，行RT-PCR檢測(cè)β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組Morris水迷宮逃避潛伏期、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間 與空白對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯減少、平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組逃避潛伏期明顯縮短、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加、平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見(jiàn)表1。

表1 各組Morris水迷宮逃避潛伏期、經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間的比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度 形態(tài)學(xué)觀察，空白對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、緊密、多層規(guī)則、細(xì)胞核大核仁清晰；模型組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列松散、層數(shù)減少、不規(guī)則、細(xì)胞核固縮、體積減小、細(xì)胞周隙明顯；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較模型組明顯數(shù)量增多、體積增大、細(xì)胞周隙縮小、細(xì)胞固縮壞死減少。見(jiàn)圖1。

2.3各組腦組織海馬區(qū)β-catenin、GSK-3β、Synapsin1及PSD-95的蛋白陽(yáng)性表達(dá)和mRNA水平 與空白對(duì)照組比較，模型組Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白(β-catenin、GSK-3β)和海馬區(qū)與記憶相關(guān)的蛋白(Synapsin1、PSD-95)的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和mRNA水平明顯降低(P<0.05)， 鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組β-catenin、GSK-3β和海馬區(qū)Synapsin1、PSD-95蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和mRNA水平亦顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組β-catenin、GSK-3β和海馬區(qū)Synapsin1、PSD-95蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和mRNA水平明顯升高(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和姜黃素組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

組別β-catenin蛋白GSK-3β蛋白Synapsin1蛋白PSD-95蛋白 β-catenin mRNAGSK-3β mRNASynapsin1 mRNAPSD-95 mRNA空白對(duì)照組 6.42±0.57 6.91±0.766.12±0.536.04±0.31 1.69±0.15 1.85±0.261.49±0.121.16±0.05模型組 1.19±0.151)1.24±0.381)1.17±0.421)0.98±0.161) 0.37±0.061)0.52±0.051)0.31±0.051)0.22±0.031)鹽酸多奈哌齊組4.05±0.211)2)4.36±0.411)2) 3.97±0.351)2)3.82±0.341)2)1.12±0.111)2)1.24±0.181)2) 1.07±0.091)2)0.81±0.071)2)姜黃素組4.18±0.391)2)4.29±0.521)2) 4.01±0.481)2)3.91±0.271)2)1.18±0.091)2)1.29±0.131)2) 1.15±0.081)2)0.86±0.041)2)

3 討 論

AD是老年癡呆的常見(jiàn)類型，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其發(fā)病率和死亡率隨著社會(huì)人口老齡化、生活壓力的增加而逐年升高〔7～9〕。

姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取出的一種多酚類化合物，以往研究表明姜黃素具有較好的生理活性，能夠清除自由基、降血脂、抗炎、抗腫瘤及抑制Aβ的神經(jīng)毒性作用，其在癡呆領(lǐng)域里應(yīng)用有著潛在的防治意義〔10，11〕。AD與Wnt信號(hào)分子有著密切的聯(lián)系，Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白可以通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于神經(jīng)細(xì)胞膜，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)靶基因活動(dòng)〔12〕。Wnt信號(hào)通路是生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，也是人體發(fā)育過(guò)程重要的信號(hào)通路之一，如果Wnt信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白發(fā)生突變，將會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展尤為重要〔13～15〕。Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin和GSK-3β能調(diào)控海馬區(qū)記憶蛋白海馬區(qū)Synapsin1和PSD-95，AD小鼠β-catenin、GSK-3β的下調(diào)能誘導(dǎo)記憶蛋白Synapsin1、PSD-95的下調(diào)〔16～18〕。

綜上，姜黃素與鹽酸多奈哌齊有同樣的治療效果，能顯著提高AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；其可通過(guò)上調(diào)β-catenin、GSK-3β和記憶蛋白Synapsin1、PSD-95的蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度及mRNA水平，提高AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以發(fā)揮防治AD的作用。