李艷玲，宋阿琳，盧玉秋，王恩召，唐治喜，劉雄舵,2，范分良*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081；2 湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南株洲 412007）

根際是根—土壤—微生物相互作用的熱區(qū)，微生物是根際中最為活躍的組分[1]。在根際互作過程中，微生物受到各種生物或非生物因素的調(diào)控，進而形成具有特定結(jié)構(gòu)與功能的根際微生物群落[2]。根際微生物能夠直接增強植物獲得養(yǎng)分的能力[3]，或通過參與土壤養(yǎng)分循環(huán)過程，提高土壤養(yǎng)分的生物有效性，間接改變植物養(yǎng)分的獲得量[4]。同時，根際微生物還能夠通過釋放多種信號物質(zhì)來影響植物的生長發(fā)育和系統(tǒng)抗性[5]，包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白、幾丁質(zhì)等生物活性物質(zhì)[6-8]，水楊酸、茉莉酸、乙烯等激素類化合物[9]，AHL等群體感應(yīng)信號分子[10]，DAPG和綠膿菌素等抗菌劑[11-12]，以及近年來引起學(xué)術(shù)界高度關(guān)注的另一類特殊的信號物質(zhì)——揮發(fā)性有機物 (volatile organic compounds，VOCs)。已報道的VOCs大多是烷烴、烯烴、醇、苯醚、醛、酮、萜烯等100～500 Da的小分子化合物，具有低分子量、低沸點、高蒸汽壓、弱極性、親脂性的特點[13]，因而具有能夠長距離傳播、介導(dǎo)有機體間非直接接觸的相互作用和低濃度即可被感知等優(yōu)勢，在長距離的根際互作中起著重要作用，在未來農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而相關(guān)報道大多是在實驗室條件下，研究少數(shù)幾種微生物釋放的VOCs與特定植物生長間的相互關(guān)系，較少考慮土壤因素[14]，對于自然條件下玉米根際VOCs的產(chǎn)生與釋放特征更是知之甚少。

微生物和植物都能夠釋放豐富的VOCs。許多研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物可以通過釋放VOCs顯著地影響植物生長[15-17]，誘導(dǎo)植物對病原體的抗性[18-20]，促進植物次生代謝物產(chǎn)生[21]，或直接抑制植物病原體[22-23]。例如植物促生芽胞桿菌釋放的2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮 (乙偶姻) 能夠顯著促進擬南芥的生長[24]，玉米促生根際細菌運動節(jié)桿菌 (Arthrobacteragilis)UMCV2產(chǎn)生的二甲基正十六胺能夠促進紫花苜蓿(Medicago sativa) 的生長和發(fā)育[25]。同樣，植物也可以通過釋放VOCs來抑制病原菌生長或招募更多的有益微生物以抵御病蟲害的侵染。Schulz-Bohm等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物釋放的VOCs可以吸引土壤中遠處的細菌向根部遷移，當(dāng)受到真菌侵染時，根部釋放的VOCs化學(xué)組分發(fā)生改變，從而吸引更多具有抗真菌特性的細菌。玉米植株在被根甲蟲幼蟲侵襲時會在根際釋放大量 (E)-β-石竹烯，從而增強對線蟲的吸引力[27]。在鐮刀菌侵染下，玉米和其他谷類植物也可以迅速釋放出倍半萜[28-29]。在受到致病疫霉接種的影響下，馬鈴薯植株的類萜釋放量會顯著升高[30]。土壤理化性質(zhì)是影響根際細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)最重要的因素[31-33]，不同性質(zhì)土壤中根際微生物群落的初始狀態(tài)不同，且不同的土壤理化性質(zhì)還可以調(diào)節(jié)根際碳沉積模式和植物生理特性，間接影響根際微生物群落，進而可能會影響土壤中VOCs的產(chǎn)生[13,15,34]。玉米是我國重要的糧食作物，種植區(qū)分布廣泛，各地農(nóng)田土壤差異較大。以往的研究多是針對某一玉米主產(chǎn)區(qū)，研究不同耕作管理措施對土壤微生物群落的影響[35-36]，而關(guān)于不同土壤中玉米根際微生物群落特征及其與VOCs的相關(guān)性研究還未見報道。

因此，本研究選擇我國華北和華東6個不同地點的農(nóng)田土進行盆栽試驗，利用頂空固相微萃取聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù) (Headspace solid phase microextraction-Gas chromatography/mass spectrometry，SPME-GC/MS)、實時熒光定量PCR和高通量測序技術(shù)對玉米苗期根際揮發(fā)性有機物和微生物群落進行檢測鑒定，進而分析比較不同土壤中玉米根際揮發(fā)性有機物的變化特征及其產(chǎn)生差異的原因。

1 材料與方法

1.1 供試材料與盆栽試驗

分別從我國山東德州、河北淶水、河南孟津、江西南昌、河南商丘、河北保定等6個地區(qū)采集耕層 (0—20 cm) 土壤。取回后過3 mm篩，剔除雜質(zhì)，混勻備用?；A(chǔ)土樣pH的測定采用電位法 (水土比為2.5∶1)，有機質(zhì)的測定采用重鉻酸鉀容量法，全氮的測定采用開氏消煮法，硝態(tài)氮的測定采用氯化鈣浸提雙波長比色法，速效磷的測定采用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法，速效鉀的測定采用醋酸銨浸提火焰光度法，土壤機械組成與粒度分析采用激光粒度分析儀法，每個樣品測定3個平行[37](表1)。

用無菌塑料袋分裝土壤，每袋3 kg，每種土壤設(shè)5個重復(fù)，統(tǒng)一添加足量養(yǎng)分 (N 150 mg/kg、P2O5100 mg/kg、K2O 100 mg/kg、鈣鎂50 mg/kg、鐵錳硼鋅鉬銅5 mg/kg)，調(diào)節(jié)含水量至田間持水量的60%，充分混勻，在室溫下培養(yǎng)30天，使土壤微生物群落恢復(fù)穩(wěn)定。

將盛有培養(yǎng)土的塑料袋直接放入盆中。選擇質(zhì)量相近、外形相似的玉米種子 (供試品種為鄭單958)，用30%雙氧水浸泡30 min后，再用無菌水洗凈并浸泡24 h，然后平鋪置于無菌玻璃大培養(yǎng)皿中，在30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。種子萌發(fā)后，每盆種4株玉米。待幼苗長至2 cm以上進行間苗，最終每盆保留2株長勢均勻一致的幼苗。盆栽試驗在溫室中進行，期間統(tǒng)一澆灌滅菌水，并且定期隨機調(diào)換盆的位置。

2個月后，采集玉米根際土，一份風(fēng)干，用于測定土壤理化性質(zhì)；一份保存于4℃，用于檢測土壤VOCs；一份保存于 -20℃，用于測定土壤微生物。

1.2 土壤基本理化性質(zhì)的測定

土壤pH和銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷、速效鉀等有效養(yǎng)分的測定方法參照文獻[37]。

1.3 揮發(fā)性有機物的收集與檢測

采用頂空固相微萃取 (SPME) 的方法收集土壤釋放的揮發(fā)性有機物。將土樣從冰箱取出后，在室溫下放置2 h。分別稱取10 g(干土重) 土壤于20 mL玻璃頂空瓶 (配中空螺紋鋁蓋和聚四氟乙烯隔墊，CNW，DE)，統(tǒng)一調(diào)節(jié)含水量至25%，在25℃條件下培養(yǎng)7天。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維裝配在SPME手動萃取手柄上 (Supelco, Bellefonte,PA, USA)，在25℃條件下頂空萃取10 h，未裝樣品的頂空瓶作為對照[17,38-39]。萃取完成后立即用7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜分析儀 (Agilent Technologies，USA) 進行檢測分析。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soils

色譜條件：進樣口溫度250℃，進樣時間3 min；不分流模式，載氣為99.999%的高純氦氣，柱流量為1 mL/min。柱箱升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以8℃/min的速度升溫至180℃，再以10℃/min的速度升溫至240℃，保持6 min。質(zhì)譜條件：離子化方式為EI，70eV；離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度250℃；掃描方式為全掃描，掃描范圍35～450 amu。測得的VOCs質(zhì)譜在NIST/EPA/NIH數(shù)據(jù)庫中進行比對鑒定[17,38]。

1.4 土壤DNA的提取與實時熒光定量PCR(qPCR)

稱取0.5 g保存于-20℃的土壤樣品，用Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒和Fast Prep-24核酸提取儀 (MP Biomedicals,Solon, OH, USA) 提取土壤總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA提取質(zhì)量，用NanoDrop 2000微量分光光度計 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 檢測其濃度和純度，保存于-20℃冰箱備用。

qPCR在Roche LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)上進行，選用的熒光試劑是SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ。qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：單克隆轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)后，用柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，PicoGreen測定濃度后逐步稀釋到108～101拷貝數(shù)，保存于-80℃[40]。細菌16S rRNA的擴增引物是357F和518R，真菌18S rRNA的擴增引物是FF390 和 FR1。擴增體系均為 15 μL，包含 7.5 μL 2 ×SYBRPremix Ex TaqⅡ、0.3 μL50 × ROX Reference Dye、10 μmol/L 的前后引物各 0.3 μL、2 μL 稀釋20倍的模板DNA和4.6 μL ddH2O，每個樣品3次重復(fù)。細菌擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃解鏈10 s，52℃退火10 s，72℃延伸20s，45個循環(huán)。真菌擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃解鏈10 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s，45個循環(huán)。

1.5 微生物群落結(jié)構(gòu)的高通量測定

將提取的DNA原液稀釋至約5 mg/L作為PCR擴增模板。

細菌16S rRNAV4-V5可變區(qū)序列的擴增引物是515F 和 806R[32]，擴增體系為 50 μL，包含 5 μL10 ×buffer、4 μL dNTP、0.5 μL rTaq(Takara)、10 μmol/L的前后引物各 1 μL、2 μL 模板 DNA 和 36.5 μL ddH2O，每個樣品3次重復(fù)。擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃解鏈45 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。將3個重復(fù)的DNA擴增產(chǎn)物混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

真菌ITS2序列的擴增采用兩輪擴增法。第一輪擴增引物為ITS1F和ITS4[41]，擴增體系為25 μL，包含 2.5 μL10 × buffer、2 μL dNTP、0.25μL rTaq(Takara)、10 μmol/L 的前后引物各 0.5 μL、1 μL 模板DNA和18.25 μL ddH2O，每個樣品3次重復(fù)。第一輪擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃解鏈40 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，20個循環(huán)；72℃延伸10 min。第二輪擴增引物為ITS3和ITS4[42,43]，擴增體系為 50 μL，包含 5 μL10 × buffer、4 μL dNTP、0.5 μL rTaq(Takara)、10 μmol/L 的前后引物各 1 μL、2 μL第一輪擴增所得模板DNA和36.5μL ddH2O。第二輪擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃解鏈30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min。將3個重復(fù)的DNA擴增產(chǎn)物混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

用PicoGreen試劑盒測定所得細菌和真菌PCR產(chǎn)物濃度，分別等量混勻后，采用DNA純化試劑盒(TIANGEN Biotech, Beijing, China) 進行純化回收。通過IlluminaHiseq2500平臺進行細菌16S和真菌ITS序列測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

高通量序列用USEARCH軟件包分析[44]，先去除質(zhì)量數(shù)低于20以及與引物存在錯配的序列，再將剩余高質(zhì)量序列統(tǒng)一修剪至250 bp。序列中的嵌合體用UCHIME過濾[45]。以97%相似性水平通過UPARSE進行OTU聚類[46]。每個樣品的細菌和真菌OUT分別抽平至79589和299條序列。以85%的置信水平為標(biāo)準(zhǔn)，在RDP(http://pyro.cme.msu.edu/) 平臺對代表序列進行物種分類注釋，并在各個分類水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成。

采用Excel 2013和SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用單因素ANOVO進行方差分析，利用Duncan法進行多重比較 (P ＜ 0.05)。豐富度指數(shù)(Richness)、香農(nóng)-威爾指數(shù) (Shannon-Wiener index)、辛普森指數(shù) (Simpson index) 和Chao1指數(shù) (Chao1 index) 等微生物多樣性指標(biāo)的計算公式見文獻[47]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米根際土壤基本化學(xué)性質(zhì)

不同采樣點土壤pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷、速效鉀等指標(biāo)存在顯著差異 (表2)。南昌根際土呈較強酸性，pH值低至4.13，其他土壤均呈中性。南昌土壤的銨態(tài)氮含量顯著高于其他地點，分別是德州、淶水、孟津、商丘和保定的59.6、45.5、36.8、64.8、56.2倍。硝態(tài)氮含量由高到低依次為孟津 ＞ 德州 ＞ 商丘 ＞ 保定 ＞ 淶水 ＞ 南昌，其中德州比商丘高35.1%，商丘比保定高56.6%，而南昌土壤的硝態(tài)氮含量僅為淶水的0.6%。速效磷含量變化范圍為18.41～64.70 mg/kg，不同土壤間均存在顯著差異，含量由高到低依次為保定 ＞ 德州 ＞ 商丘 ＞ 南昌 ＞ 孟津 ＞ 淶水。德州土壤速效鉀含量較高，其次是淶水、孟津、南昌、商丘，而保定土壤的速效鉀含量相對較低。

2.2 不同采樣點土壤玉米根際揮發(fā)性有機物

從6個土壤中共檢出44種VOCs，主要是烷烴、烯烴、酯類、胺類、有機酸和芳香類化合物 (表3)。不同土壤釋放的VOCs存在顯著差異 (圖1)，其中南昌土壤釋放的VOCs在數(shù)量和豐富度上均顯著大于其他土壤。共檢測出35種VOCs，僅從德州、淶水、孟津、商丘和保定土壤中分別檢測出4種、3種、3種、3種和8種VOCs。

組分上，N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35) 和D-2-Bromolysergic acid diethylamide(No.38)在6種土壤中均被檢出，分別占總量的48.5%和5.0%，但是孟津土壤釋放的D-2-Bromolysergic acid diethylamide(No.38) 顯著多于其他土壤，而南昌土壤釋放的N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35)顯著少于其他土壤。(Z)-9-Octadecenamide(No.43) 在德州土壤被檢出，Supraene(No.44) 在孟津土壤被檢出，而Sulfurous acid, dodecyl 2-ethylhexyl ester(No.32)、Tridecane, 3-methyl-(No.33)、Morpholine, 4-octadecyl-(No.39)、Undecanoic acid isopropyl ester,10-hydroxy-11-morpholin-4-(No.40)、Palmitoleic acid(No.41) 和 n-Hexadecanoic acid(No.42) 在保定土壤被檢出；在南昌土壤中被檢出的VOCs有33種，其中相對含量大于2%的依次為Propane, 1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl-(No.8)、N-Benzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide(No.35)、Guaia-1(10),11-diene(No.37)、Heptadecane,8-methyl-(No.10)、Dodecane,2,6,10-trimethyl-(No.19)、Propanoic acid, phenyl ester(No.13)、Heptane,2,2,4,6,6-pentamethyl-(No.5) 和 Octane, 1,1'-oxybis-(No.21)。

表2 玉米根際土壤化學(xué)性質(zhì)Table 2 Chemical properties of maize rhizosphere soils

2.3 不同采樣點土壤玉米根際微生物群落特征

2.3.1 細菌和真菌種群數(shù)量及多樣性 6種不同土壤中玉米根際細菌和真菌種群數(shù)量存在差異 (表4)。各處理的細菌數(shù)量變化范圍為2.8 × 109～4.9 ×109/g，其中保定和商丘的細菌數(shù)量較高，與德州、淶水、孟津和南昌的差異達到顯著水平。真菌數(shù)量變化范圍為 1.3 × 106/g ～ 4.2 × 107/g，其中孟津、商丘、保定、淶水和德州的真菌數(shù)量均顯著低于南昌，分別是南昌土壤的6.7%、4.8%、4.5%、3.3%和3.1%。

由表4可知，6種土壤的細菌豐富度在3859～5059范圍內(nèi)變動，其中商丘的細菌豐富度最高，與淶水和南昌的差異達到顯著水平；南昌的細菌豐富度最低，與其他5個處理均存在顯著差異。6種土壤的真菌豐富度在81～127范圍內(nèi)變動，其中德州的真菌豐富度最高，與商丘和南昌差異顯著。從香農(nóng)-威爾指數(shù)、辛普森指數(shù)和Chao1指數(shù)來看，玉米根際土壤細菌和真菌多樣性在德州、淶水、孟津、商丘和保定間的差異都不顯著，但是均顯著高于南昌土壤的細菌和真菌多樣性。

2.3.2 細菌和真菌群落結(jié)構(gòu) 從6種土壤中共檢測出31個細菌門，其中共有細菌門27個。相對豐度大于2%的細菌有7個，占總細菌群落的92.1%，分別是Thaumarchaeota(奇古菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)和Unclassified(未分類門)，相對豐度依次為23.9%、15.6%、14.9%、12.3%、11.3%、7.9%和6.2%。主要細菌門在不同土壤中的相對豐度存在顯著差異 (圖2A)。在德州、淶水、孟津、南昌、商丘、保定等6種土壤中，Thaumarchaeota的群落相對豐度分別為29.7%、15.5%、21.2%、5.2%、36.8%、34.9%，Actinobacteria的群落相對豐度分別為14.9%、21.8%、16.0%、17.8 %、12.3%、11.1%，Proteobacteria的群落相對豐度分別為15.3%、21.1%、18.7%、7.2%、13.4%、14.0%，Chloroflexi的群落相對豐度分別為7.6%、3.3%、6.6%、44.7%、5.0%、6.8%，Acidobacteria的群落相對豐度分別為14.5%、16.5%、13.2%、3.3%、10.0%、10.0%，F(xiàn)irmicutes的群落相對豐度分別為4.3%、6.1%、9.5%、6.3%、10.1%、10.9%。

從6種土壤中共檢測出7個真菌門，其中共有真菌門5個。相對豐度大于1%的真菌有3個，占總真菌群落的98.3%，分別是Ascomycota(子囊菌門)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門) 和 Chytridiomycota(壺菌門)，相對豐度依次為93.4%、3.0%和1.9%。主要真菌門在不同土壤中的相對豐度也存在顯著差異 (圖2B)。Ascomycota在6個處理中均占絕對優(yōu)勢，群落相對豐度占84.0%～98.0%，其中孟津、南昌、商丘與保定間的差異達到顯著水平，分別高出16.7%、15.6%、15.2%；Basidiomycota群落相對豐度占0.3%～12.5%，其中保定的相對豐度顯著高于其他處理，分別比德州、淶水、孟津、南昌和商丘高8.8%、7.5%、13.4%、7.1%、45.8%；Chytridiomycota群落相對豐度占0.1%～7.8%，其中淶水的相對豐度較其他處理更高。

表3 玉米根際土壤釋放的揮發(fā)性有機物Table 3 Volatile organic compounds released from maize rhizosphere soils

圖1 不同采樣點玉米根際土壤釋放的VOCs數(shù)量與組成Fig. 1 Quantity and composition of VOCs emitted from different maize rhizosphere soils[注（Note）：DZ—山東德州Dezhou, Shandong；LS—河北淶水Laishui, Hebei；MJ—河南孟津Mengjin, Henan；NC—江西南昌Nanchang, Jiangxi；SQ—河南商丘Shangqiu, Henan；XL—河北保定Baoding, Hebei.]

基于97%相似度的OTU數(shù)據(jù)，采用weighted Unifrac算法分別對不同土壤中玉米根際微生物群落結(jié)構(gòu)進行了主坐標(biāo)分析 (PCoA)。對于細菌群落 (圖3A)，第一主成分和第二主成分的方差貢獻率分別為52.96%和14.42%，累計方差貢獻率為67.38%；德州、孟津、商丘和保定的細菌群落結(jié)構(gòu)和組成相似，聚集分布于第三象限；南昌分布于第四象限，在PCoA1軸上與其余5個處理明顯分開；淶水分布于第二象限，在PCoA2軸上與其余5個處理明顯分開。對于真菌群落 (圖3B)，第一主成分和第二主成分的方差貢獻率分別為19.85%和13.82%，累計方差貢獻率為33.67%；德州、淶水、孟津和商丘的真菌群落結(jié)構(gòu)和組成比較相似，主要分布于第四象限；南昌在PCoA1軸上的坐標(biāo)為負值，與其余5個處理明顯分開；保定分布于第一象限，在PCoA2軸上與其余5個處理明顯分開。

2.4 玉米根際VOCs與土壤理化性質(zhì)和微生物群落的相關(guān)性

從表5可以看出，玉米根際釋放的VOCs數(shù)量和豐富度與pH和硝態(tài)氮含量呈極顯著負相關(guān) (P ＜0.01)，與銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)。真菌數(shù)量與VOCs數(shù)量和豐富度呈極顯著正相關(guān)，細菌多樣性與VOCs數(shù)量和豐富度呈極顯著負相關(guān)，真菌多樣性與VOCs數(shù)量呈極顯著負相關(guān)，與VOCs豐富度呈顯著負相關(guān) (P ＜ 0.05)。主要細菌門中，奇古菌門、變形菌門和酸桿菌門與VOCs數(shù)量和豐富度呈顯著或極顯著負相關(guān)，綠彎菌門與VOCs數(shù)量和豐富度呈極顯著正相關(guān)；主要真菌門與玉米根際釋放的VOCs數(shù)量及豐富度相關(guān)性不顯著。

3 討論

土壤VOCs的萃取效率受水分、溫度等環(huán)境條件的影響[48]，本研究中各處理VOCs的收集和檢測均在相同的水分和溫度條件下進行。最終從供試的6種土壤中共檢測出44種VOCs，主要是烷烴、烯烴、酯類、胺類、有機酸和芳香類化合物，其中檢出最多的是胺類化合物N-Benzyl-N-ethyl-pisopropylbenzamide (No.35) 和D-2-Bromolysergic acid diethylamide (No.38)，占總量的54.2%；其次是烷烴和烯烴，占總量的31.1%和7.6%。這些化合物的化學(xué)性質(zhì)與前人報道的植物或微生物釋放的揮發(fā)性化合物極為相似，因此本研究中檢測到的VOCs可能主要來源于玉米根系和根際微生物[5,13,15,49-50]。

本研究從玉米根際土壤檢出的VOCs中未發(fā)現(xiàn)2,3-丁二醇、乙偶姻、二甲基二硫醚、β-石竹烯等典型的具有促生功能的揮發(fā)性物質(zhì)[5,13,24,27]，但其中多種化合物可能與植物或微生物生長代謝密切相關(guān)。NBenzyl-N-ethyl-p-isopropylbenzamide (No.35) 是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的能夠有效抑制黃曲霉生長的抗真菌揮發(fā)性化合物之一[51]，在由細菌分泌的有助于維持微囊藻菌落結(jié)構(gòu)的胞外化合物中也曾被檢出[52]。D-2-Bromolysergic acid diethylamide (No.38) 是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較多的一種致幻劑[53]，然而其在植物根際互作方面的研究還未見報道。Guaia-1 (10), 11-diene (No.37) 具有體外抑菌活性[54]。促生巨大芽孢桿菌菌株XTBG34釋放的VOCs中包含Dodecane, 2,6,10-trimethyl-(No.19)[55]。Raza 等[17]和 Jishma 等[56]研究發(fā)現(xiàn)，Hexacosane (No.20) 和 Tetradecane (No.28) 能促進植物生長，而Heptane, 2,2,4,6,6-pentamethyl- (No.5)、Palmitoleic acid (No.41)、n-Hexadecanoic acid (No.42)和Supraene (No.44) 會抑制植物生長。2-Methyl-2-bornene (No.6) 可能主要來自土壤中的放線菌[57]，具有標(biāo)記土壤微生物活動和組成的潛在作用[58]。Hussein等[59]研究結(jié)果表明 (Z)-9-Octadecenamide(No.43) 會抑制細菌生長。從組成成分上看，南昌玉米根際VOCs組分與許多報道有相似之處。例如，Zhang等[60]研究發(fā)現(xiàn)非致病尖刀鐮刀菌F.oxysporum CanR-46產(chǎn)生的VOCs主要包括烯烴類、烷類、酯類、有機酸，其中大多數(shù)化合物屬于烯烴并具有廣譜的抗真菌活性。Schulz-Bohm等[26]研究VOCs在苔草Carex arenaria和黃色鐮刀菌F. culmorum互作過程中發(fā)現(xiàn)，Carex arenaria根釋放的VOCs以芳族化合物為主 (49%～51%)，能夠吸引土壤中較遠的細菌向根部遷移，F(xiàn). culmorum釋放的VOCs大部分是萜類 (21%)，但是受F. culmorum侵染的植物根際產(chǎn)生了更多的烷烴和單萜烯，有效吸引了具有抗真菌特性的細菌。今后有必要通過購買標(biāo)準(zhǔn)品或有效的分離手段進一步驗證各種VOCs的生態(tài)功能，闡明其具體來源和作用機制，從而將具有重要生態(tài)調(diào)節(jié)功能的VOCs應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

菌1 4 a 1 9 5 ±真F u n g i 3 1 a 1 6 a b 2 3 c 1 3 a b 1 1 a b數(shù)2 0 7 ±1 8 7 ±1 2 6 ±1 4 6 ±1 6 0 ±指a o 1 a b b c a c a a 0.0 5).C h C h a o 1 i n d e x菌± 1 5 3± 1 9 1± 2 6 0± 1 6 9± 1 1 4± 1 7 2細B a c t e r i a 6 4 0 9 5 8 8 9 6 7 1 8 5 5 3 9 6 9 1 2 6 5 8 9 t s (P ＜e n t r e a t m a a a a a 0.0 7 0.0 2 0.0 5菌n g i 0.8 1 ±0.0 7 0.6 4 ±0.0 5 0.0 7 0.7 3 ±數(shù)辛S i m p s o n i n d e x 0.4 5 ±0.7 0 ±0.7 6 ±真F u i f f e r e n c e s a m o n g普指h e r e s o i l s森菌B a c t e r i a b細± 0.0 0 1 a 0.9 9± 0.0 0 2 a 0.9 9± 0.0 0 1 a 1.0 0± 0.0 0 4 b 0.9 8± 0.0 0 3 a 0.9 9± 0.0 0 3 a 0.9 9 e a n s i g n i f i c a n t d樣a i z e r h i z o s p n m性菌0.1 3 a 0.2 1 a b 0.2 6 a b 0.1 7 c 0.2 3 a b 0.3 3 a e c o l u m多真F u n g i其數(shù)2.2 8 ±1.8 7 ±1.7 6 ±1.3 2 ±1.8 3 ±2.3 1 ±及指爾量數(shù)f u n g i i n m威-菌農(nóng)n o n-W i e n e r i n d e x真香菌和S h a n細± 0.0 6 a± 0.1 4 a± 0.1 2 a± 0.1 2 b± 0.1 9 a± 0.2 2 a菌B a c t e r i a y d i f f e r e n t l e t t e r s i n t h e s a m細6.2 1 6.4 4 6.5 5 5.4 7 6.1 3 6.1 0米d i v e r s i t y o f b a c t e r i a a n d壤土a b b際8 a 1 8 9 a b 1 6 8 b 7 a b根菌n g i真F u 7 ±5 ±2 ±8 1 ±8 8 ±4 ±a t a f o l l o w e d b 4 玉1 2 u a n t i t y a n d 1 0 1 1 1 1度富＜ 0.0 5) D表豐R i c h n e s s 4 a b 7 b 4 a b 3 c 2 a 1 a b(P菌1 4 1 7 2 3 1 5 1 1 1 6平水T a b l e 4 Q 細B a c t e r i a 4 7 2 6 ±4 4 9 9 ±5 0 1 5 ±3 8 5 9 ±5 0 5 9 ±4 8 3 6 ±著顯到達異(c o p i e s/g, s o i l)s 差1 0 7)(×i c r o o r g a n i s m菌F u n g u s± 0.0 3 b± 0.0 6 b± 0.1 3 b± 0.5 9 a± 0.0 7 b± 0.0 9 b間理處真0.1 3 0.1 4 0.2 8 4.2 0 0.2 0 0.1 9示表數(shù)e r o f m 母量字物1 0 9)寫小生微N u m b (×菌B a c t e r i a± 0.4 8 b± 0.3 9 b± 0.4 5 b± 0.1 5 b± 0.4 9 a± 0.3 6 a同細3.5 1 3.2 8 3.0 6 2.8 1 4.8 4 4.9 3不后據(jù)數(shù)g p o i n t 列同x i點a n ：e i e i S a m p l i n g 樣e n e b e b a n e n采山D e z h o u, S h a n d o n, J i a n g州水津昌丘i u 定河L a i s h u i, H o t e）江N a n c h a n g淶德孟, H南商保（N東北河M e n g j i n, H南西河S h a n g q南河B a o d i n g, H北注

圖2 不同采樣點玉米根際土壤細菌 (A) 和真菌 (B) 群落組成Fig. 2 Community composition of bacteria (A) and fungi (B) in different maize rhizosphere soils[注（Note）：DZ—山東德州Dezhou, Shandong；LS—河北淶水Laishui, Hebei；MJ—河南孟津Mengjin, Henan；NC—江西南昌Nanchang, Jiangxi；SQ—河南商丘Shangqiu, Henan；XL—河北保定Baoding, Hebei.]

圖3 不同采樣點玉米根際土壤細菌 (A) 和真菌群落 (B) 的主坐標(biāo)分析Fig. 3 Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungi communities (B) in different maize rhizosphere soils[注（Note）：DZ—山東德州Dezhou, Shandong；LS—河北淶水Laishui, Hebei；MJ—河南孟津Mengjin, Henan；NC—江西南昌Nanchang, Jiangxi；SQ—河南商丘Shangqiu, Henan；XL—河北保定Baoding, Hebei.]

本研究中，玉米根際土壤釋放的VOCs在不同土壤間存在差異，尤其是南昌土壤釋放的VOCs在數(shù)量和種類上均顯著大于其他5種土壤。相關(guān)性分析結(jié)果進一步表明，玉米根際釋放的VOCs與土壤理化性質(zhì)和微生物群落的多個指標(biāo)呈顯著相關(guān)關(guān)系。一方面，不同土壤的機械組成和理化性質(zhì)存在較大差異，會影響VOCs在土壤孔隙間及其從土壤向空氣擴散的過程[48]。南昌供試土壤為酸性紅壤，有機質(zhì)含量較低，土壤中的層狀硅酸鹽礦物遭到破壞，砂粒含量較高，其土壤顆粒對VOCs的吸附作用較弱，利于VOCs擴散到空氣中[61]。另一方面，通過qPCR和高通量測序結(jié)果可知，不同土壤中的根際微生物數(shù)量、多樣性以及群落結(jié)構(gòu)和組成存在顯著差異，影響了土壤中VOCs的產(chǎn)生[13,15,34]。VOCs數(shù)量和豐富度與真菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)，即當(dāng)南昌玉米根際土壤中真菌數(shù)量顯著高于其他土壤時，產(chǎn)生的VOCs也更豐富。同時，GC/MS鑒定結(jié)果表明，南昌土壤釋放的VOCs大部分是烷烴及其衍生物和烯烴，而大量研究已發(fā)現(xiàn)多種真菌會釋放豐富的以烷烴、烯烴為主的揮發(fā)性物質(zhì)[5,26,31,48,60,62-63]。從保定土壤中檢出的6種特有的有機酸和酯類化合物，可能是保定土壤中含量較高的有機質(zhì)在豐富的土壤細菌的作用下分解產(chǎn)生的次生代謝物，同時由于保定土壤砂粒含量較高、表面積較小，良好的透氣性使土壤中的VOCs更多地向空氣擴散[17]。門水平上，玉米根際釋放的VOCs與不同微生物的相關(guān)性存在顯著差異，與奇古菌門、變形菌門和酸桿菌門呈顯著負相關(guān) (P ＜ 0.05)，與綠彎菌門呈極顯著正相關(guān) (P ＜ 0.01)，今后或許可以據(jù)此來方便快捷地監(jiān)測不同土壤中微生物的動態(tài)變化情況。

表5 玉米根際VOCs數(shù)量和豐富度與土壤理化性質(zhì)和微生物群落間的相關(guān)性分析Table 5 Pearson correlation analysis of abundance and richness of VOCs in maize rhizosphere soils with soil physiochemical properties and microbial community

4 結(jié)論

理化性質(zhì)不同的玉米根際土壤中，微生物群落結(jié)構(gòu)與組成存在顯著差異。pH是影響微生物生長的重要因素，酸性土壤中的真菌數(shù)量顯著高于中性土壤，但是其細菌數(shù)量、微生物群落豐富度和多樣性均顯著小于中性土壤。玉米根際土壤釋放的VOCs主要是烷烴、烯烴、酯類、胺類、有機酸和芳香類化合物，其中多種化合物與植物或微生物的生長代謝密切相關(guān)，具有重要的生態(tài)學(xué)潛能。VOCs的產(chǎn)生和釋放受土壤、微生物和植物等眾多因素的影響，土壤有機質(zhì)含量越高、透氣性越好、微生物數(shù)量越多時，釋放的VOCs越豐富。今后，有必要探索更加高效準(zhǔn)確的土壤VOCs分析方法，深入探究各類VOCs的生態(tài)功能和作用機制，從而使之成為幫助評估土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)以及調(diào)控根際微生物群落的重要手段。