(云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院， 昆明 650500)

對(duì)植物的基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯是研究基因功能和作物遺傳性狀改良的重要方法。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)是目前最新一代的基因組編輯技術(shù)，其工作原理是核酸酶Cas 9蛋白在向?qū)NA(short guide RNA，sgRNA)的引導(dǎo)下，對(duì)目的基因進(jìn)行切割，導(dǎo)致雙鏈斷裂，雙鏈DNA在修復(fù)時(shí)會(huì)引入堿基的插入、缺失等變異，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變[1]。相比于其他基因組編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡(jiǎn)單，成本低廉，易于在實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)等顯著優(yōu)勢(shì)，因此目前已廣泛應(yīng)用于擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianabenthamiana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)以及番茄(Solanumlycopersicum)[2-8]等多種植物的基因組編輯。

馬鈴薯是全球第四大糧食作物，遺傳資源豐富，其中超過(guò)70%為二倍體馬鈴薯，是馬鈴薯作物遺傳改良的珍貴資源[9]。二倍體馬鈴薯相對(duì)于四倍體基因組簡(jiǎn)單、易于轉(zhuǎn)化，因此在二倍體馬鈴薯材料中利用基因敲除等工具驗(yàn)證基因的功能更容易實(shí)現(xiàn)。2015年，Wang等[10]在雙單倍體DM中實(shí)現(xiàn)了對(duì)StIAA2的定點(diǎn)敲除；2017年，Andersson等[11]在四倍體馬鈴薯的原生質(zhì)體中通過(guò)對(duì)StGBSS的定點(diǎn)突變?cè)俳?jīng)過(guò)原生質(zhì)體再生，獲得了富含支鏈淀粉的馬鈴薯株系；2018年，Ye等[9]通過(guò)對(duì)二倍體馬鈴薯S.tuberosumgroup Phureja S 15-65中的S-RNase的定點(diǎn)突變獲得了可自交的種質(zhì)，這說(shuō)明基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯中的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟。然而，穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化是基因功能驗(yàn)證的必要手段，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的二倍體馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在基因型帶來(lái)的顯著差異，因此建立一套快速驗(yàn)證基因組編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化體系十分必要，不僅可以對(duì)載體的效率以及靶點(diǎn)的穩(wěn)定性進(jìn)行判斷，也為后期的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化提供有效的保證。

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)可以侵染植物并在受傷部位誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，也叫發(fā)狀根。發(fā)狀根具有生長(zhǎng)迅速、周期短、多分枝等優(yōu)點(diǎn)，因此發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物、根發(fā)育相關(guān)基因的功能驗(yàn)證及植物與微生物間的互作等領(lǐng)域[12]。發(fā)根農(nóng)桿菌相較于根癌農(nóng)桿菌對(duì)于材料的選擇較為廣泛，對(duì)于侵染的材料以及材料的基因型沒(méi)有特異性選擇。更重要的是相較于根癌農(nóng)桿菌，發(fā)根農(nóng)桿菌分化出發(fā)狀根的時(shí)間更短，更利于遺傳轉(zhuǎn)化后的瞬時(shí)驗(yàn)證。雖然發(fā)根農(nóng)桿菌侵染馬鈴薯已有報(bào)道[13]，但將CRISPR/Cas 9編輯系統(tǒng)應(yīng)用于馬鈴薯發(fā)狀根尚未見(jiàn)報(bào)道。首先CRISPR/Cas 9系統(tǒng)在載體的設(shè)計(jì)上易出現(xiàn)錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)操作中也容易出現(xiàn)難以察覺(jué)的堿基突變，對(duì)于載體的工作有很大影響；其次對(duì)于不同靶點(diǎn)編輯效率，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)也有很大的差異性，而利用傳統(tǒng)的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化不僅實(shí)驗(yàn)周期慢長(zhǎng)，遺傳轉(zhuǎn)化效率低。所以用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)驗(yàn)證靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)與分子實(shí)驗(yàn)的誤差，就加大了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的工作量，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期。所以需要一套快速基因編輯載體檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)基因靶點(diǎn)的編輯效率來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，以證明CRISPR載體的適用性。馬鈴薯StCDF1(CYCLINGDOFFACTOR)是控制成熟期(熟性)的重要基因，當(dāng)其和LOV藍(lán)光受體蛋白StFKF1和生物鐘核心蛋白StGI相互作用的結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變時(shí)，可促使馬鈴薯的塊莖提早形成[14]。因此，本試驗(yàn)選取StCDF1作為靶基因，通過(guò)構(gòu)建基于CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的基因編輯載體，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染馬鈴薯，建立了CRISPR/Cas 9介導(dǎo)的發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，驗(yàn)證了StCDF1基因敲除載體的高效性，同時(shí)通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了StCDF1基因編輯的植株，為后續(xù)研究StCDF1基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了寶貴的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所選用的所有植物材料均為二倍體材料S. tuberosum group Phureja S 15-65下文簡(jiǎn)稱為CIP-65，從國(guó)際馬鈴薯中心引進(jìn)，編號(hào)CIP 703541。發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為Ar. Qual。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1二倍體馬鈴薯無(wú)菌苗的培養(yǎng)

CIP-65采用MS 30培養(yǎng)基(4.43 g·L-1MS粉末+20 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8)進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)菌苗培養(yǎng)條件如下：溫度(19±1)℃，整體組培屋光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，16 h的光照培養(yǎng)，8 h黑暗培養(yǎng)。

1.2.2馬鈴薯外植體的預(yù)培養(yǎng)

馬鈴薯無(wú)菌苗培養(yǎng)4周后，切取不帶腋芽的莖段，莖段選擇偏粗綠健壯，置于預(yù)培養(yǎng)基(MS 30+1.0 mg·L-1玉米素+2.0 mg·L-1奈乙酸)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的光照條件培養(yǎng)溫度與無(wú)菌苗的培養(yǎng)條件相同。

1.2.3CRISPR/Cas 9-StCDF1載體的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序后拼接的StCDF1基因序列，在此序列上設(shè)計(jì)了1個(gè)敲除位點(diǎn)。將靶點(diǎn)序列的5'加上ATTG，它的反向互補(bǔ)序列的5'加上AAAC的BsaI的酶切位點(diǎn)合成引物。2條sgRNA的引物分別是F:ATTGGATTCATGATCCAAATGAAG;R：AAACCTTCATTTGGATCATGAATC。所用的載體為PKSE 402，該載體包含有GFP表達(dá)元件，載體構(gòu)建的方法參考文獻(xiàn)[15]。

注：從左到右特美汀濃度分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 ml·L-1圖1 生根培養(yǎng)基上特美汀濃度的篩選

注：a為自然光下的發(fā)狀根；b為熒光下的發(fā)狀根(白色箭頭標(biāo)注的為疑似熒光根)。圖2 用熒光手電筒對(duì)轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根進(jìn)行初步篩選

1.2.4發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和侵染

每100μL的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)加入0.05μg質(zhì)粒，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化采用凍融法。經(jīng)PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性菌落保存于-80 ℃冰箱中。侵染前先將菌液培養(yǎng)至OD=0.05，搖好的農(nóng)桿菌用高速低溫離心機(jī)，轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，離心10 min，去上清，再用MS 20液體重懸制備成發(fā)根農(nóng)桿菌侵染液。在經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，將預(yù)培養(yǎng)的莖段收集，將莖段放入侵染液，緩慢搖晃侵染的莖段，讓農(nóng)桿菌與莖段接觸充分，當(dāng)侵染結(jié)束后，先把菌液瀝干，將外植體置于3層無(wú)菌濾紙上吸干多余菌液。農(nóng)桿菌菌液吸干后把外植體轉(zhuǎn)入加上一層無(wú)菌濾紙上的培養(yǎng)基中于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.2.5發(fā)根培養(yǎng)基的抗性篩選

將暗培養(yǎng)培養(yǎng)了48 h的莖段收集好后，挑選40個(gè)外植體分別平均轉(zhuǎn)移至發(fā)根培養(yǎng)基(MS 30+特美汀)，特美汀設(shè)置了4種濃度，分別為0 mg·L-1，2 mg·L-1，4 mg·L-1，6 mg·L-1。培養(yǎng)溫度(19±1)℃，整體組培屋光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，16 h的光照培養(yǎng)，8 h黑暗培養(yǎng)。

1.2.6熒光根的篩選

培養(yǎng)8 d后，取下發(fā)狀根放置于MS 30固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，用熒光手電筒進(jìn)行初步篩選。經(jīng)過(guò)初步篩選后，將有熒光的根切下，放入MS固體培養(yǎng)上,再進(jìn)行熒光顯微鏡的鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

為了防止農(nóng)桿菌溢出，保證發(fā)狀根的正常生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)探索了合適濃度的特美汀。共設(shè)計(jì)了4個(gè)濃度梯度，分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1。在4個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)分別放置10個(gè)左右的外植體，利用相同濃度的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體，侵染時(shí)間也相同的處理?xiàng)l件下，不同濃度的特美汀的培養(yǎng)皿中外植體的狀況不同。從圖1可以看出，不加特美汀的培養(yǎng)基上農(nóng)桿菌有溢出現(xiàn)象，不利于發(fā)狀根的產(chǎn)生，而特美汀濃度過(guò)大則會(huì)抑制發(fā)狀根的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)又采用相同的外植體，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均是2 mg·L-1的特美汀濃度下的發(fā)狀根生長(zhǎng)最迅速，發(fā)狀根的數(shù)量最多。因此，在本試驗(yàn)體系中，2 mg·L-1的特美汀濃度既可以抑菌，也可以保證發(fā)狀根的正常生長(zhǎng)，最快8 d即可以進(jìn)行DNA的提取驗(yàn)證。

2.2 基因編輯載體的驗(yàn)證

為了方便篩選轉(zhuǎn)基因根，在載體中包含了綠色熒光蛋白。對(duì)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的發(fā)狀根，首先用熒光手電筒進(jìn)行了初步篩選(圖2)。有熒光的發(fā)狀根進(jìn)一步在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照，可以明顯的觀察到陽(yáng)性根的熒光發(fā)亮程度遠(yuǎn)大于其自發(fā)熒光(圖3)。

二倍體馬鈴薯發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化總共進(jìn)行了3批，每批侵染外植體40個(gè)，每1批的40個(gè)外植體中可以篩出40條熒光根，再?gòu)拿颗?0條熒光根中隨機(jī)抽取10條熒光根進(jìn)行測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)3次編輯的熒光根分別為7條、8條、8條，證明CRISPR/Cas 9-StCDF1載體能夠進(jìn)行高效的基因編輯。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了熒光篩選的可靠性，說(shuō)明了二倍體馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系可以依靠熒光篩選對(duì)載體的工作效率進(jìn)行快速判斷。

注：a為明場(chǎng)下觀察轉(zhuǎn)化陽(yáng)性發(fā)狀根；b為明場(chǎng)下觀察轉(zhuǎn)化陰性發(fā)狀根；c為GFP 熒光通道下觀察轉(zhuǎn)化陽(yáng)性發(fā)狀根；d為GFP熒光通道下觀察轉(zhuǎn)化陰性發(fā)狀根。圖3 熒光顯微鏡下對(duì)轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根進(jìn)行篩選

2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的獲得

發(fā)根農(nóng)桿菌體系驗(yàn)證了CRISPR/Cas 9-StCDF1載體能夠工作，將該載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌并侵染馬鈴薯莖段。共侵染了200個(gè)莖段，經(jīng)過(guò)抗生素篩選、及編輯靶點(diǎn)測(cè)序后，最終獲得1株雜合突變體，之后經(jīng)過(guò)進(jìn)一步將PCR產(chǎn)物回收并連接T載體測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該突變植株為野生和缺失5 bp的雜合突變體(圖5)。

圖4 基于發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根 基因組的編輯類型

圖5 基于根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的植株 基因組的編輯情況

3 討 論

本試驗(yàn)以馬鈴薯熟性基因StCDF1為靶標(biāo)，建立了二倍體馬鈴薯基因編輯載體的快速驗(yàn)證辦法。該方法相較于目前主流的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化，首先發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)對(duì)于實(shí)驗(yàn)材料的狀態(tài)要求較低，其次沒(méi)有較多的精細(xì)繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作。在操作的時(shí)間上可以快速(約8 d)判斷出編輯載體是否工作以及估算出選擇靶點(diǎn)的適用性。且發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)比原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化平臺(tái)更有優(yōu)勢(shì)的是—其驗(yàn)證的CRISPR載體是最終的雙元載體也就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的終載體，而原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化則不能，其只能檢測(cè)中間載體的工作效率，檢測(cè)后還需要進(jìn)行進(jìn)一步的載體改造后才能作為最終載體。為了進(jìn)行高通量的篩選，建議首先使用熒光手電進(jìn)行粗篩選，再將篩選到的根用熒光顯微鏡，進(jìn)行仔細(xì)鑒別，排除自發(fā)熒光的干擾。此種篩選途徑，可以滿足高通量的大批陽(yáng)性轉(zhuǎn)化根的篩選，又保證了篩選的準(zhǔn)確性。

馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈(Andes)中部西麓、瀕臨太平洋的秘魯和玻利維亞區(qū)域，受到光周期的影響，許多馬鈴薯品種在短日照條件才能正常結(jié)薯[16]。根據(jù)之前的研究，調(diào)控開(kāi)花途徑中的一些元件如光敏色素B(PHYB)、CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)、CDF轉(zhuǎn)錄因子等在馬鈴薯響應(yīng)光周期變化調(diào)控塊莖形成的途徑中起著關(guān)鍵作用[16]，然而它們之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的還不是很清楚，本研究創(chuàng)制的StCDF1缺失5 bp的雜合突變體為研究這一科學(xué)問(wèn)題提供了寶貴的材料。

此外，除了快速驗(yàn)證載體，發(fā)根農(nóng)桿菌系統(tǒng)也可被用于研究參與次生代謝產(chǎn)物途徑的基因。植物中數(shù)量巨大的次生代謝產(chǎn)物與作物的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等性狀密不可分，例如，馬鈴薯的塊莖在貯藏過(guò)程中易積累龍葵素，產(chǎn)生令人不悅的苦澀味[17]。通過(guò)CRISPR/Cas 9編輯龍葵素合成代謝途徑基因，轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，可直接檢測(cè)發(fā)狀根中代謝產(chǎn)物的變化，有利于快速鑒定基因的功能。