張穎慧，岳 華.2，馬艷君，冉 艾，何琪富，湯 承.2

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041)

牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)是嚴(yán)重危害肉牛養(yǎng)殖業(yè)的一類疾病，對全世界肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1].BRDC 在臨床上主要以流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲下降、呼吸困難等癥狀為特點. 由于BRDC 危害嚴(yán)重，國外對其進(jìn)行了大量的研究，已證實其病原包括病毒、細(xì)菌和支原體等.在臨床上，病毒感染牛呼吸道后造成牛呼吸道上皮細(xì)胞受到破壞，并可能抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，在繼發(fā)細(xì)菌性感染時加重BRDC 的臨床癥狀[1].已經(jīng)證實的致BRDC 的病毒包括：牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛病毒性腹瀉- 黏膜病病毒(bovine viral diarrhoea virus， BVDV)、牛副流感3 型病毒(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛腺病毒3 型(bovine adenovirus type 3，BAV3)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)、D 型流感病毒(influenza D virus，IDV)、牛鼻炎A 病毒(bovine rhinitis A virus，BRAV)和牛鼻炎B 病毒(bovine rhinitis B virus，BRBV)等病毒[2]；常見的細(xì)菌包括：多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，M. haemolytica)和睡眠嗜組織菌(Histophilussomni，H.somni)等細(xì)菌[1]；盡管感染牛的支原體種類較多[3]，但在BRDC 中牛支原體(Mycoplasma bovis， M.Bovis)為主[1].臨床上不同的地區(qū)的BRDC，其病原種類可能存在差異，且常呈混合感染[4-5]，使得其診斷和防治變得困難.

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們物質(zhì)生活的提高，對牛肉的需求越來越大.加之國家政策的扶持，肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速[6]. 由于國內(nèi)肉牛種源的相對缺乏，從外地引進(jìn)犢?；蛘呒茏优＿M(jìn)行短期育肥[7]，是包括四川省在內(nèi)的很多地方肉牛養(yǎng)殖的普遍現(xiàn)狀.運輸應(yīng)激是BRDC 爆發(fā)的重要誘因，從異地引進(jìn)牛群造成的運輸應(yīng)激，使機(jī)體抵抗力降低，從而導(dǎo)致牛群BRDC 的爆發(fā)[8]，已經(jīng)成為制約國內(nèi)肉牛養(yǎng)殖的一個重要問題[9]. 由于我國對BRDC 的相關(guān)研究起步較晚，防控基礎(chǔ)薄弱[10]，進(jìn)一步加強(qiáng)國內(nèi)BRDC 的病原流行病學(xué)調(diào)查，是制定科學(xué)防控策略的前提.

目前，國內(nèi)已鑒定的BRDC 的病原包括IBRV、BRSV、BPIV3、BAV3、BVDV、BCoV、M. Bovis、P. multocida 和M.haemolytica 等[11-13]，但是其病原流行病學(xué)資料還較少. 對我國多地奶牛BRDC 的病原檢測表明，IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BRSV 等病毒感染普遍[14-16]，并且個別地區(qū)M. Bovis 和P. multocida 感染率很高[10]. 盡管在生產(chǎn)實際中肉牛BRDC 已經(jīng)成為制約肉牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要問題[9]，但是目前國內(nèi)肉牛BRDC 病原流行病學(xué)資料較少[12]，且對病毒、細(xì)菌和支原體等多種病原混合感染情況的調(diào)查報告僅有一篇[17].本實驗?zāi)康氖菍λ拇ㄊ?1 個從外地引種肉牛群爆發(fā)的BRDC 臨床樣本中10 種常見的病原，包括病毒、細(xì)菌、支原體等進(jìn)行檢測，為國內(nèi)肉牛的BRDC 防控提供參考.

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

2016 年10 月～2018 年6 月采自四川省5 個市11 個引種肉牛場的BRDC 樣本共計108 份.樣本采集的牛群為從外地引進(jìn)的3 ～10 月齡的肉犢牛和架子牛，在引進(jìn)后5 ～14 d 內(nèi)表現(xiàn)出流鼻涕、咳嗽、呼吸困難、發(fā)燒等臨床癥狀.樣本詳細(xì)信息見表1.

1.2 主要試劑

TrizolTMReagent、PrimescriptTM反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、Premix taq 等購自TaKaRa 公司；Stool DNA Kit 核酸提取試劑盒購自O(shè)MEGA BIO -TEK 公司；TrackItTMUltra Low Range DNA Ladder 購自Thermo Fisher 公司.

1.3 檢測10 種病原的PCR 方法

參考文獻(xiàn)[13、16、18 -23]報道的的PCR 方法分別對IBRV、BVDV、BCV、BPIV3、BRSV、BAV3、M. Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni 進(jìn)行檢測，引物信息見表2.引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表1 108 份BRDC 樣本信息Table 1 Sample information of 108 BRDC

表2 10 種病原檢測引物信息Table 2 The primers for detection of 10 pathogens

1.4 M.haemolytica 莢膜血清型1、2 和6 型鑒定方法

采用文獻(xiàn)[24]報道的鑒定M.haemolytica 莢膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法對M.haemolytica 陽性樣本進(jìn)行鑒定. 莢膜血清型1 型擴(kuò)增片段長度為306bp，位于Hyp 基因序列，引物上下游分別為1F：CATTTCCTTAGGTTCAGC， 1R： CAAGTCATCGTAATGCCT；莢膜血清型2 型擴(kuò)增片段長度為160bp，位于Core2 基因序列，引物上下游分別為2F：GGCATATCCTAAAGCCGT，2R：AGAATCCACTATTGGGCACC；莢膜血清型6 型擴(kuò)增片段長度為78bp，位于TupA 基因序列，引物上下游分別為6F：TGAGAATTTCGACAGCACT，6R：ACCTTGGCATATCGTACC.

1.5 核酸提取

將采集的108 份BRDC 樣本，分別用5 mL PBS處理，劇烈混勻后，取上清液5 000 r/min 4 ℃離心10 min，分別取300 μL 于滅菌的1.5 mL EP 管中(每個樣本兩份).采用Trizol 法提取108 份BRDC 樣本的RNA，并采用PrimescriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；同時采用Stool DNA Kit 核酸提取試劑盒提取108 份BRDC 樣本的DNA.核酸于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.6 臨床樣本檢測

采用文獻(xiàn)[13、16、18 -23]報道的IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BRSV、BAV3、M. Bovis、P. multocida、M.haemolytica、H. somniPCR 檢測方法對11 個牛場108份BRDC 樣本進(jìn)行檢測.并采用文獻(xiàn)[24]報道的鑒定M.haemolytica 莢膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法對M.haemolytica 陽性樣本進(jìn)行鑒定.

2 結(jié)果

2.1 108 份BRDC 樣本10 種病原檢測結(jié)果

對11 個牛場108 份BRDC 樣本中10 種常見病原的檢測結(jié)果顯示，IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 的平均陽性率分別為37%(40/108)、16.7%(18/108)、4.6%(5/108)、5.6%(6/108)、6.5%(7/108)、24.1%(26 /108)、6.5%(7/108)、46.3%(50/108)和5.6% (6/108)，BRSV 未檢出；IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 的場陽性率分別為8/11、3/11、2/11、2/11、4/11、5/11、2/11、8/11 和3/11，其中IBRV、M. Bovis和M. haemolytica 的場陽性率較高，且三者混合感染情況嚴(yán)重，見表3.

2.2 M.haemolytica 陽性樣本1、2 和6 莢膜血清型鑒定結(jié)果

采用文獻(xiàn)[24]報道的鑒定M. haemolytica1、2 和6 莢膜血清型的多重PCR 方法，對M. haemolytica 陽性樣本分型鑒定結(jié)果顯示，50 份M. haemolytica 陽性樣本中30 份為莢膜血清型6 型(30/50)，8 份為血清莢膜型1 型(8/50)，3 份為莢膜血清型2 型(3/50)，9份陽性樣本未確定型，見圖1.

圖1 部分M.haemolytica 莢膜血清型1、2 和6 型鑒定結(jié)果Fig.1 Partial identification results of the capsular serotypes1，2 and 6 of M. haemolytica

表3 108 份BRDC 樣本病原陽性檢出率Table 3 The positive rate of the 10 pathogens from 108 samples

3 討論

隨著我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，肉牛養(yǎng)殖數(shù)目顯著增多，而由于受市場供求關(guān)系和產(chǎn)業(yè)布局等因素的影響，我國肉牛長距離、大范圍的調(diào)運也顯著增多[9].在運輸過程中，引種肉牛群受到多種應(yīng)激因素的刺激，加之在病原微生物的作用下，導(dǎo)致牛群BRDC 的爆發(fā)[8].本實驗對采自四川省11 個引種肉牛群的108份BRDC 樣本中10 種常見的病原檢測結(jié)果顯示，9 種病原被檢出，包括IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni，說明國內(nèi)引種肉牛群感染病原種類復(fù)雜，但不同病原在不同牛場的檢出率不同，如IBRV 在個別牛場的檢出率很高(11/14)，也有牛場未檢出；不同病原的場陽性率也不相同，證明不同地區(qū)感染的病原存在差異；IBRV、M.Bovis 和M. haemolytica 的場陽性率和個體陽性率均較高，說明IBRV、M.Bovis 和M.haemolytica 是導(dǎo)致引種肉牛群爆發(fā)BRDC 的常見原因.個別牛場病原混合感染嚴(yán)重，如采自四川省宜賓市的一牛場引種肉牛群中檢測出9 種病原，且多種病原的檢出率均較高(IBRV 10/13、BVDV 7/13、M.Bovis7/13、M.haemolytica11/13)，使得防控難度增加. 有必要進(jìn)一步加強(qiáng)我國主要肉牛供應(yīng)地的病原流行病學(xué)調(diào)查，包括健康帶毒情況的調(diào)查，為引種肉牛BRDC 的防控提供參考.

BRDC 病因復(fù)雜，一般認(rèn)為病毒是BRDC 爆發(fā)的主要原因，國外常見的病毒是IBRV、BVDV、BCoV、BRSV、BPIV3 等[2]. 國內(nèi)已有較多關(guān)于IBRV 和BPIV3 的病原流行病學(xué)資料[15-16]，表明其是國內(nèi)BRDC 的常見病原[10].本實驗BVDV 和BCoV 的平均陽性率為16.7%和4.6%，但個別牛場中BVDV 和BCoV 的陽性率較高(分別為10/14 和3/14)；國內(nèi)BVDV 和BCoV 與腹瀉相關(guān)的病原流行病學(xué)調(diào)查已較多[18-19]，但其與BRDC 相關(guān)的報道不多. 國外BVDV和BCoV 是BRDC 的常見病原，BVDV 是致加拿大BRDC 重要病原之一，其陽性率高達(dá)69%[25]；BCoV是巴西爆發(fā)BRDC 的常見病原，其在巴西BRDC 牛群中陽性率可達(dá)22%[4].因此，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對我國BVDV 和BCoV 在BRDC 中流行情況的調(diào)查.BAV3在美國的陽性率為48%[2]，國內(nèi)已有分離BAV3 的報道[13]，但其流行情況還不清楚. 盡管在本實驗中BAV3 的平均陽性率只有6.5%，但是在4 個牛場中均檢出BAV3，且來自兩個不同的省區(qū). 結(jié)合國內(nèi)BAV3 分離株情況[13]，表明該病原在我國可能廣泛分布，有必要進(jìn)一步開展其流行病學(xué)調(diào)查.

細(xì)菌和支原體在BRDC 中扮演著重要角色，病毒感染牛呼吸道后，造成牛呼吸道上皮細(xì)胞受損和牛的免疫系統(tǒng)受到抑制，從而細(xì)菌和支原體等病原體侵入牛下呼吸道，引起繼發(fā)感染，加重BRDC 的爆發(fā)[1].國外M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica 和H.somni 等是導(dǎo)致BRDC 的重要病原菌，國內(nèi)關(guān)于M.Bovis 和P.multocida 的流行病學(xué)資料已較多[9]，其是我國BRDC的重要致病病原，本研究中M.Bovis 和P.multocida 的平均陽性率分別為24.1%和6.5%.M.haemolytica 屬于條件致病菌，通常寄生于上呼吸道，主要在鼻咽和扁桃體隱窩中.按照M.haemolytica 莢膜抗原的不同，可分為12 種莢膜血清型((1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16 和17)，不同血清型毒力差別較大.M.haemolytica 莢膜血清型1 和6 型是主要致BRDC 的主要莢膜血清型[24].本實驗中M.haemolytica 的平均陽性率為46.3%(50/108)，場陽性率為8/11，并且莢膜血清型1 和6 型的比例高達(dá)38/50，表明該菌是目前國內(nèi)致肉牛BRDC 的重要原因之一. 目前國內(nèi)關(guān)于M. haemolytica 分離鑒定已較多[12]，但是關(guān)于其流行的主要莢膜血清型的報道較少[12]，加強(qiáng)對M.haemolytica 莢膜血清型的鑒定非常有必要.

H.somni 是國外引起B(yǎng)RDC 的重要病原菌，如該菌在巴西BRDC 牛中陽性率高達(dá)39%，是導(dǎo)致BRDC的重要致病病原之一[4]. H. somni 除了引起牛肺炎之外，還能幫助致BRDC 病毒如BRSV 逃避宿主防御[26]，并且還與血栓栓塞性腦膜腦炎、纖維性心包炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎-漿膜炎、流產(chǎn)和生殖道感染等疾病有關(guān)[23]. 國內(nèi)采用PCR -DGGE 技術(shù)從健康肉牛生殖道中檢測到H. somni[27]，但還未見H. somni 與BRDC 相關(guān)的報道.本實驗中H. somni 的檢出率不高(5.6%)，但是被檢出的6 份樣本是來自3 個省區(qū)的引種肉牛群，表明該菌可能有較廣泛的地域分布.

4 結(jié)論

本實驗對四川省11 個外地引種牛場爆發(fā)BRDC的108 份臨床樣本進(jìn)行10 種病原檢測，結(jié)果表明包括IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni 等9 種病原均有檢出，說明感染病原復(fù)雜，且不同地區(qū)感染病原的種類具有差異；IBRV、M. Bovis、M. haemolytica 1 型和6 型的個體陽性率和場陽性率均較高，表明其在BRDC 中的作用值得關(guān)注.