趙遠(yuǎn)超，葉 茂，孫明明，張忠云，黃 丹，朱國(guó)繁,3，鄭曉璇，晁會(huì)珍，馮彥房，武 俊*，胡 鋒，蔣 新

生物質(zhì)炭與噬菌體聯(lián)用阻控與滅活土壤–生菜體系中抗生素抗性致病細(xì)菌①

趙遠(yuǎn)超1,2，葉 茂2*，孫明明1，張忠云2，黃 丹2，朱國(guó)繁2,3，鄭曉璇1，晁會(huì)珍1，馮彥房4，武 俊1*，胡 鋒1，蔣 新2

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京? 210095；2 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；3 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230009；4 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014)

農(nóng)田土壤–蔬菜體系中殘留和滋生的多種抗生素抗性致病細(xì)菌已對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境安全造成較嚴(yán)重的隱患，因此開(kāi)展針對(duì)性的風(fēng)險(xiǎn)管控技術(shù)研究十分迫切。生物質(zhì)炭阻控與農(nóng)業(yè)噬菌體療法聯(lián)用靶向滅活土壤–蔬菜體系中抗生素抗性致病細(xì)菌，為解決此類污染土壤問(wèn)題提供了全新途徑。本研究以自主制備的抗生素抗性致病細(xì)菌(攜帶四環(huán)素抗性基因W的大腸桿菌K12，攜帶氯霉素抗性基因C的銅綠假單胞菌PAO1)污染農(nóng)田土壤為盆栽用土，開(kāi)展生菜土培試驗(yàn)60 d。設(shè)置單獨(dú)或同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種廣宿主型噬菌體(YSZ?5K)的不同處理，以土壤–生菜體系中K12、PAO1數(shù)量變化及W、C豐度消減程度表征聯(lián)合修復(fù)的效果。結(jié)果表明，針對(duì)土壤–生菜體系中殘留K12、PAO1和W、C消減程度變化，判斷不同處理效果，依次為：BP(生物質(zhì)炭與噬菌體聯(lián)用)> B(單獨(dú)施用生物質(zhì)炭)>P(單獨(dú)接種噬菌體)> CK(對(duì)照)，其中BP處理?xiàng)l件下，K12與PAO1在土壤和生菜葉片中數(shù)量較之對(duì)照處理下降了2.1 ~ 3.1個(gè)數(shù)量級(jí)，W和C豐度較之對(duì)照處理下降了2.2 ~ 3.3個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，在BP處理?xiàng)l件下，生菜收獲后，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性和穩(wěn)定性指數(shù)也得到顯著提升，證明該聯(lián)合治理方式是一種較為環(huán)境友好的修復(fù)技術(shù)。本研究結(jié)果可為降低土壤–蔬菜體系中抗性致病細(xì)菌的殘留風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)和有效的管控技術(shù)。

土壤–蔬菜體系；生物質(zhì)炭；農(nóng)業(yè)噬菌體療法；抗生素抗性致病細(xì)菌

由于抗生素類獸藥的濫用、畜禽糞便安全化處理技術(shù)的不足及環(huán)境管理的缺失，中國(guó)及世界范圍內(nèi)許多國(guó)家的城郊畜牧業(yè)養(yǎng)殖廠周邊農(nóng)田土壤-蔬菜系統(tǒng)，常成為殘留和滋生抗生素抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的高風(fēng)險(xiǎn)熱點(diǎn)“源”和“匯”，尤其是在大量環(huán)境中可移動(dòng)基因元件(質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子)水平轉(zhuǎn)移或垂直轉(zhuǎn)導(dǎo)的促進(jìn)作用下，一些人畜共患抗生素抗性致病細(xì)菌的擴(kuò)散傳播風(fēng)險(xiǎn)更會(huì)大大增加，同時(shí)給人體健康和生態(tài)安全帶來(lái)了極為嚴(yán)重的潛在威脅[1-2]。因而，開(kāi)展針對(duì)性降低風(fēng)險(xiǎn)的阻控技術(shù)和消除風(fēng)險(xiǎn)的生物靶向滅活技術(shù)研發(fā)已十分迫切和必要。

生物質(zhì)炭(biochar)是一種多孔隙、吸附能力強(qiáng)、可提供土著微生物著床的環(huán)境友好型功能材料[3]。有研究表明，在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)周邊農(nóng)田土壤、醫(yī)療廢棄物處理廠和垃圾填埋場(chǎng)周邊覆土中，添加生物質(zhì)炭可高效廣譜性協(xié)同阻控多種ARB和ARGs在土壤-植物體系中的傳播路徑、傳播頻率和傳播距離，環(huán)境中ARB和ARGs的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)在生物質(zhì)炭的阻隔、吸附、促消減作用下得到有效降低[4-6]。然而，基于生物質(zhì)炭的阻控技術(shù)雖可以顯著降低風(fēng)險(xiǎn)，但并未從根本上消除風(fēng)險(xiǎn)。仍然需要進(jìn)一步研發(fā)深度滅活土壤-植物體系中抗生素抗性致病細(xì)菌的生物靶向修復(fù)技術(shù)。

噬菌體療法的出現(xiàn)為解決上述問(wèn)題提供了一種全新途徑。細(xì)菌噬菌體(簡(jiǎn)稱噬菌體)是一類專屬性捕食活體宿主細(xì)菌而存活的生物體，在土壤、水、空氣乃至人和動(dòng)物體表或腸道內(nèi)均廣泛分布，據(jù)估算其總量達(dá)到1031數(shù)量級(jí)[7-8]。噬菌體療法是指通過(guò)分離、篩選、純化和富集宿主細(xì)菌的專屬噬菌體之后，向污染土壤-植物體系中添加特定噬菌體菌液，定向侵染并滅活抗性致病細(xì)菌的修復(fù)方式[9-11]。已有學(xué)者成功將噬菌體療法應(yīng)用在滅活葡萄、辣椒、番茄等果蔬的植物病害細(xì)菌或人畜共患致病細(xì)菌的食品安全保障領(lǐng)域[12-14]。此外，前期研究常認(rèn)為噬菌體僅限于侵染某一“種”類的宿主細(xì)菌，但近年來(lái)學(xué)術(shù)界越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)：噬菌體經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕蚋脑旎蛉斯ぜ铀俣ㄏ蝰Z化后，可針對(duì)同一“屬”內(nèi)幾種高度同源性的宿主細(xì)菌，甚至針對(duì)不同種屬之間的宿主細(xì)菌也具有一定廣譜性捕食區(qū)間[15-17]。這為噬菌體療法進(jìn)一步廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

基于上述研究背景，本研究將自主制備復(fù)合抗生素抗性致病細(xì)菌污染土壤，模擬實(shí)際污染土壤現(xiàn)狀，進(jìn)行生菜土培試驗(yàn)。探究單獨(dú)及聯(lián)合使用生物質(zhì)炭阻控技術(shù)和廣宿主型噬菌體療法滅活技術(shù)，協(xié)同消除土壤-生菜體系內(nèi)復(fù)合抗性致病細(xì)菌的過(guò)程與效果。同時(shí)基于修復(fù)過(guò)程中土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和功能多樣性變化，綜合評(píng)價(jià)此聯(lián)合修復(fù)技術(shù)的環(huán)境效應(yīng)。本研究結(jié)果可為同步高效阻控和深度靶向滅活農(nóng)田土壤-蔬菜體系中多種致病細(xì)菌的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，提供環(huán)境友好、行之有效的生物修復(fù)技術(shù)，具有廣泛應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種 生菜為意大利全年耐抽苔生菜(L.)，河北金發(fā)種業(yè)有限公司。

1.1.2 供試土壤 采自南京城郊某奶牛場(chǎng)(32°30′ 45″N，118°94′7″E)附近農(nóng)田土壤，采用五點(diǎn)取樣法，取0 ~ 10 cm的表層土壤，于暗處4 °C冷藏保存。測(cè)定土樣基本理化性質(zhì)[18]：沙粒238 g/kg，壤粒454 g/kg，黏粒318 g/kg，pH 7.7，全氮1.7?g/kg，水溶性氮1.7?g/kg，全磷1.3?g/kg，全鉀17.5?g/kg，CEC 19.4?cmol/kg。

1.1.3 供試生物質(zhì)炭 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院面源污染治理與水體修復(fù)研究室提供，以玉米秸稈為原料，300 ℃高溫?zé)?，測(cè)定其基本理化性質(zhì)[19]：全碳556.4?g/kg，全氮13.6?g/kg，C/N?35.6，灰分186.5?g/kg，全磷2.3?g/kg，全鉀11.6?g/kg，pH?9.5。

1.1.4 供試菌株 攜帶四環(huán)素抗性基因W和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的大腸桿菌K12(K12)與攜帶氯霉素抗性基因C和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因的銅綠假單胞菌(PAO1)及廣宿主型噬菌體YSZ?5K(頭長(zhǎng)徑約110?nm，橫徑約80?nm，尾長(zhǎng)約120?nm；最佳感染復(fù)數(shù)MOI = 0.1)均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5 試驗(yàn)儀器與試劑 激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica?DM?5000B)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied?Biosystems?StepOnePlusTM)，BIOLOG(MicroStation TM，型號(hào)：14060316，華粵行儀器有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱，Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用溫室盆栽試驗(yàn)，每個(gè)盆缽稱取8?kg供試土壤，每個(gè)盆缽中同時(shí)接種100 ml濃度為107cfu/ml的K12(GFP，W)和PAO1(RFP，C)菌液，制備獲得原始抗性致病細(xì)菌污染土壤。設(shè)有4組處理：①對(duì)照組(CK)：每盆種植3棵生菜(在種子上覆土0.5 ~ 1 cm，室溫18℃±2℃)；②生物質(zhì)炭處理(B)：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加生物質(zhì)炭(10 g/kg)；③噬菌體處理(P)：在對(duì)照組基礎(chǔ)上接種100 ml濃度為108pfu/ml的廣宿主型噬菌體YSZ 5K；④生物質(zhì)炭和噬菌體聯(lián)合處理(BP)：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加生物質(zhì)炭并接種噬菌體YSZ 5K。每隔3 d澆水，保持田間最大持水率的75%。每隔10 d，在生菜根部附近隨機(jī)采集5個(gè)土樣，共取樣10 g土壤，混合均勻后，待測(cè)。并在第60天時(shí)采集新鮮生菜，去除根部附著土壤，在根與葉連接的成熟區(qū)剪斷，于暗處4 ℃低溫儲(chǔ)藏[20]。

1.3 噬菌體療法在土壤中滅活抗性致病細(xì)菌的效果

將土壤樣品與100 ml無(wú)菌水混勻，振蕩5 min，浸提10 min，取100 μl懸液稀釋到適當(dāng)濃度，并在LB平板上涂布計(jì)數(shù)，對(duì)K12和PAO1數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 噬菌體療法對(duì)土壤中抗性基因消減變化的研究

用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit For Soil，貨號(hào)：116560200)提取土壤基因組DNA，用微量分光光度計(jì)NanoDrop 測(cè)定提取的土壤DNA 的純度(OD260/OD280在1.8 ~ 2.0之間)和濃度。用qPCR(StepOnePlusTM RealTime PCR system)對(duì)W、C基因進(jìn)行豐度的定量分析(表1)。原始土壤中W、C檢測(cè)為陰性。

1.5 噬菌體療法對(duì)生菜中抗性致病細(xì)菌和抗性基因的影響

用激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710)，觀測(cè)不同處理?xiàng)l件下，新鮮生菜根和葉片中K12和PAO1的賦存狀態(tài)和定殖情況；取待測(cè)植物樣品用無(wú)菌水漂洗3 ~ 4次，剪碎后放入盛有4 ml無(wú)菌水的研缽中充分研磨，靜止后取上清，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，貨號(hào)：dp302-02)提取內(nèi)生細(xì)菌總DNA，并用qPCR(StepOnePlusTM RealTime PCR system)對(duì)W、C基因豐度進(jìn)行測(cè)定。

表1 抗性基因tetW和ampC的PCR 擴(kuò)增引物序列

1.6 土壤微生物群落功能的多樣性和穩(wěn)定分析

將1.2中采集的土壤樣品，進(jìn)行微生物群落功能多樣性和穩(wěn)定性分析。土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog?ECO測(cè)定法[21-22]。Biolog?ECO微平板中多底物酶聯(lián)反應(yīng)采用每孔的平均吸光度值(average?well?color?development，AWCD)來(lái)描述。

式中：C代表含底物試驗(yàn)孔的吸光值，代表不含底物對(duì)照孔的吸光值，31表示本試驗(yàn)中有31種碳源。土壤群落功能多樣性采用培養(yǎng)Biolog ECO微平板孔中吸光值，計(jì)算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)()和Simpson指數(shù)())。

式中：p為第孔相對(duì)吸光值(-)與整個(gè)微平板相對(duì)吸光值總和(∑OD)的比率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)采樣的平均值，利用軟件SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。圖表采用Microsoft Excel 2016和軟件OriginPro 9.0繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體療法對(duì)土壤中抗性致病細(xì)菌的滅活效果

由于本研究所使用的K12和PAO1分別標(biāo)記有穩(wěn)定遺傳的綠色熒光蛋白基因和紅色熒光蛋白基因，因而采用平板涂布計(jì)數(shù)法，可對(duì)K12和PAO1數(shù)量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖1所示，不同處理?xiàng)l件下，土壤中K12和PAO1消減程度從高到低順序依次是：BP>P>B>CK，這可能是由于生物質(zhì)炭是一種環(huán)境友好的土壤改良材料，已有較多研究表明添加生物質(zhì)炭可以有效改善土壤益生菌群在總體土著菌群中的多樣性、代謝活性和生態(tài)位比例[23-24]。因而相較于CK處理來(lái)說(shuō)，單獨(dú)添加生物質(zhì)炭的B處理，土壤中K12和PAO1的數(shù)量得到顯著抑制(<0.05)。另外，單獨(dú)接種噬菌體的處理，第 60天時(shí)，土壤中K12和PAO1殘留豐度分別為5.1×104cfu/g和5.63×104cfu/g，該結(jié)果直接驗(yàn)證了廣宿主型噬菌體療法在土壤中具有同步靶向滅活復(fù)合抗性致病細(xì)菌的能力；相較于單獨(dú)添加生物質(zhì)炭處理(B)或單獨(dú)接種噬菌體處理(P)，BP處理具有更為顯著的協(xié)同滅活效果(<0.05)，K12和PAO1的殘留數(shù)量相較于原始接種量分別下降了2.5和2.1個(gè)數(shù)量級(jí)，分別僅為4.65×104cfu/g和5.15×104cfu/g。這可能是由于土壤中添加的生物質(zhì)炭不僅可以通過(guò)吸附、阻隔作用主動(dòng)持留一部分抗性致病細(xì)菌，同時(shí)生物質(zhì)炭自身的多孔結(jié)構(gòu)和富含養(yǎng)分元素也可以讓抗性致病細(xì)菌在土壤微域環(huán)境形成相對(duì)密集的定殖區(qū)域，再加上外界的廣宿主型噬菌體的引入，充分增加噬菌體接觸到宿主致病細(xì)菌的概率，節(jié)約噬菌體尋找宿主時(shí)間和縮短噬菌體尋找宿主路徑[25]，這樣更有利于噬菌體快速侵染并滅活復(fù)合致病細(xì)菌，達(dá)到消除風(fēng)險(xiǎn)的作用。

2.2 噬菌體療法對(duì)土壤中ARGs豐度消減變化的影響

土壤中過(guò)量豐度ARGs存在，能通過(guò)食物鏈直接或間接傳遞作用增加人體獲得抗生素抗性的風(fēng)險(xiǎn)，故而ARGs也被認(rèn)為是一種新型環(huán)境生物大分子污染物。本研究同時(shí)關(guān)注不同處理?xiàng)l件對(duì)土壤中ARGs豐度消減的影響。從圖2可以看出，各組處理下土壤中ARGs豐度的消減動(dòng)態(tài)與K12和PAO1數(shù)量的消減動(dòng)態(tài)接近一致。即：?jiǎn)为?dú)或同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種噬菌體處理，對(duì)土壤中ARGs的消減有顯著效果(<0.05)；同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種噬菌體處理(BP處理)對(duì)于深度消除土壤中ARGs具有顯著的協(xié)同效應(yīng)(<0.05)，在BP處理下，土壤中ARGs消減最為顯著，兩種ARGs豐度下降幅度分別為2.2和3.2個(gè)數(shù)量級(jí)，其中W基因豐度由第1天的2.3×108copies/g下降到第60天的2.2×105copies/g，而C基因豐度由6.6×107copies/g下降到5.6×105copies/g。這可能是由于本研究檢測(cè)到的土壤中關(guān)于四環(huán)素抗性的W基因都是存在于活體K12體內(nèi)，而檢測(cè)到的關(guān)于氯霉素抗性的C基因存在于活體PAO1體內(nèi)，所以當(dāng)不同處理?xiàng)l件對(duì)土壤中K12和PAO1的增殖活性產(chǎn)生顯著抑制或者大幅度滅活殘留數(shù)量后，相應(yīng)ARGs豐度也隨之減弱。

(CK：對(duì)照組；B：?jiǎn)为?dú)添加生物質(zhì)炭處理；P：?jiǎn)为?dú)添加噬菌體處理；BP：生物質(zhì)炭與噬菌體聯(lián)用處理，下圖同)

圖2 污染土壤中抗性基因tetW與ampC的動(dòng)態(tài)變化

2.3 生物質(zhì)炭與噬菌體療法聯(lián)用追蹤滅活生菜體內(nèi)抗性致病細(xì)菌和抗性基因

ARB/ARGs從土壤向植物體內(nèi)遷移富集的過(guò)程增加了人類在食物鏈上直接接觸到抗性致病細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)。為探究生物質(zhì)炭與噬菌體療法聯(lián)用在污染土壤-生菜體系中的實(shí)際應(yīng)用，本研究使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)生菜根和葉片中K12和PAO1的賦存狀態(tài)和定殖情況(圖3)。由圖3可知：不同處理?xiàng)l件下，根部中定殖殘留的K12(綠點(diǎn))與PAO1(紅點(diǎn))數(shù)量要顯著高于葉片中殘留的K12與PAO1數(shù)量(< 0.05)；定殖的K12和PAO1主要分布和集中在植物真核細(xì)胞的間隙，尤其是較多地聚集在根部和葉片的氣孔周圍；不同處理?xiàng)l件對(duì)根葉中賦存K12和PAO1的影響具有一致的規(guī)律，即：根葉中賦存的K12和PAO1數(shù)量由高到低的順序依次是：CK>B>P>BP。上述結(jié)果說(shuō)明單獨(dú)添加生物質(zhì)炭可以有效降低K12和PAO1從土壤向生菜組織中的遷移富集；而單獨(dú)接種噬菌體則是因?yàn)橐环矫娓咝О邢驕缁盍送寥乐械腒12和PAO1，另一方面也可能由于接種的噬菌體也具有自主的移動(dòng)性，同樣可以通過(guò)根系氣孔或機(jī)械損傷部位遷移進(jìn)入植物體內(nèi)，從而深度追蹤滅活生菜體內(nèi)的復(fù)合致病細(xì)菌；對(duì)于BP處理來(lái)說(shuō)，生物質(zhì)炭在土壤中的協(xié)同阻控效應(yīng)和噬菌體療法靶向追蹤滅活效應(yīng)的疊加，更為直觀地說(shuō)明了該聯(lián)合修復(fù)方法的高效。

圖3 第60天時(shí)生菜根和葉中K12(綠點(diǎn))和PAO1(紅點(diǎn))的豐度變化(40x/0.75)

進(jìn)一步具體分析生菜組織中殘留ARB和ARGs的情況，本研究對(duì)根葉中K12和PAO1進(jìn)行了定量計(jì)數(shù)和ARGs熒光定量分析。第60天生菜收獲后，根/葉鮮樣中K12和PAO1的累計(jì)定殖總數(shù)量由高到低為：CK>B>P>BP(圖4)，與土壤中抗性細(xì)菌變化規(guī)律相似；單獨(dú)或同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種噬菌體，都可以顯著消減生菜根葉中復(fù)合致病細(xì)菌的殘留，并且賦存狀態(tài)與圖3中顯微鏡觀測(cè)到的殘留規(guī)律一致，其中BP處理最為顯著(<0.05)，殘留在生菜根葉中的K12和PAO1累計(jì)總量分別下降到5.1×104、1.9×103cfu/g。根據(jù)這一規(guī)律深入分析第60天時(shí)不同處理?xiàng)l件對(duì)殘留在根葉中ARGs豐度的變化(圖5)，發(fā)現(xiàn)：第60天時(shí)，CK處理下根和葉鮮樣中W與C累計(jì)總豐度分別可以達(dá)到5.3×106、5.1×105copies/g；而在BP處理中，根葉中殘留ARGs豐度消減最為顯著(<0.05)，W和C累計(jì)豐度較之CK下降了6.2和5.7個(gè)數(shù)量級(jí)，分別僅為4.3×103copies/g、1.8×102copies /g。上述結(jié)果綜合證明了生物質(zhì)炭阻控和噬菌體療法靶向滅活的聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，可以靶向追蹤消除土壤-生菜體系中K12和PAO1復(fù)合抗性致病細(xì)菌的殘留滋生風(fēng)險(xiǎn)，是一種行之有效的風(fēng)險(xiǎn)消除技術(shù)。

圖4 不同處理?xiàng)l件下生菜根(A)、葉(B)中K12和PAO1的賦存數(shù)量

圖5 不同處理?xiàng)l件下生菜根(A)、葉(B)中tetW和ampC的殘留豐度

2.4 噬菌體療法對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響

噬菌體療法在滅活土壤-生菜體系中抗性致病細(xì)菌的同時(shí)，可能對(duì)土壤中其他益生菌群或整體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性造成一定程度的影響，因此進(jìn)行土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估十分必要[26]。AWCD數(shù)值的變化表示土壤微生物整體代謝活性的波動(dòng)；豐富度指數(shù)Shannon()反映的是群落的豐富度, 其值越小表示樣性越低；優(yōu)勢(shì)度指數(shù)Simpson()反映土壤微生物群落常見(jiàn)種的優(yōu)勢(shì)度變化，數(shù)值越大其微生物多樣性越低。第60天后不同處理下土壤Biolog?ECO測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同處理方式土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)(第 60 天)

注：表中同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示處理間差異顯著(<0.05)。

AWCD值由高到低表現(xiàn)為BP>B>CK>P，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也佐證了這一規(guī)律(表2)，即：?jiǎn)为?dú)添加生物質(zhì)炭對(duì)土壤微生物多樣性有所增強(qiáng)，這可能是由于生物質(zhì)炭是溫和友好的土壤環(huán)境改良劑，可以大幅度改善土壤水熱通氣條件和養(yǎng)分循環(huán)周轉(zhuǎn)過(guò)程，增強(qiáng)微生物活性，提高土壤微生物群落多樣性；單獨(dú)接種噬菌體后對(duì)土壤微生物多樣性略有下降，這可能是由于接種的廣宿主型噬菌體在進(jìn)入實(shí)際土壤后為繼續(xù)存活，拓寬了其捕食區(qū)間，從而對(duì)土壤細(xì)菌群落的多樣性造成一定程度的減少；而同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種噬菌體后土壤微生物多樣性顯著增強(qiáng)(<0.05)，這可能是由于生物質(zhì)炭能夠同時(shí)吸附土著菌群和噬菌體，縮小噬菌體活動(dòng)區(qū)間，提高其靶向滅活致病細(xì)菌的效率，進(jìn)而增強(qiáng)生物質(zhì)炭吸附效果，促進(jìn)土壤中有益菌群的增長(zhǎng)。這證明了生物質(zhì)炭施用與噬菌體療法聯(lián)合使用對(duì)于維持土壤-生菜體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成多樣性具有良性貢獻(xiàn)。上述結(jié)果共同證明施用生物質(zhì)炭和接種噬菌體的聯(lián)合技術(shù)對(duì)于同步維護(hù)土著微生物群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性具有積極的作用，可以大幅度消減噬菌體療法在應(yīng)用過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的潛在負(fù)面風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)添加生物質(zhì)炭和接種廣宿主型噬菌體的聯(lián)合方式，不僅可以高效廣譜地阻控四環(huán)素抗性的K12和氯霉素抗性的PAO1從土壤向生菜體內(nèi)遷移富集的過(guò)程，還可以靶向追蹤滅活土壤-生菜體系中定殖的K12與PAO1及消減相應(yīng)攜帶的ARGs豐度。此外，該聯(lián)合修復(fù)方式對(duì)于維護(hù)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成多樣性和功能穩(wěn)定性也具有積極作用，是一種環(huán)境友好、生態(tài)安全的修復(fù)技術(shù)，可以為深度消除土壤-蔬菜系統(tǒng)中ARB和ARGs的擴(kuò)散傳播和定殖殘留風(fēng)險(xiǎn)提供一種全新思路，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Combined Biochar and Bacteriophage to Control and Inactivate Antibiotic Resistance Pathogenic Bacteria in Soil-Lettuce System

ZHAO?Yuanchao1,2, YE Mao2*, SUN Mingming1, ZHANG Zhongyun2,HUANG Dan2,ZHU Guofan2,3, ZHENG Xiaoxuan1,CHAO Huizhen1, FENG Yanfang4, WU Jun1*,HU Feng1, JIANG Xin2

(1 College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 4 Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Ubiquitous existence of antibiotic resistant pathogens (ARP) in the agricultural land and vegetation system has posed great threat against public health and environmental safety, making it essential to develop targeted controlling technologies. In this work, biochar and bacteriophage combined technology was investigated for its effectiveness in targeted inactivating the ARP in the soil-lettuce system. Biochar and polyvalent phage YSZ 5K were applied to the ARP (tetracycline resistantK12 and chloramphenicol resistantPAO1) contaminated soil. The residual K12 and PAO1 counts and antibiotic resistance genes (W andC) abundances were determined after 60 days of incubation. The results showed that the combined technology was proved most effective, followed by sole application of biochar, sole inoculation of YSZ 5K, and the control. For the combined treatment, the counts of K12 / PAO1 decreased by 2.1–3.1 magnitudes and the abundances ofW/C decreased by 2.2–3.3 magnitudes in the soil and lettuce leaves, respectively. In addition, the structural and functioning diversity of soil microbial community was improved significantly after the combined treatment. The results obtained here demonstrate the combined application of biochar and polyvalent phage YSZ 5K an environmentally-friendly technology that could effectively decrease the ARP in the soil-lettuce system.

Soil-vegetable?system;?Biochar;?Agricultural?phage?therapy;?Antibiotic?resistant?pathogenic?bacteria

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018FYC1803100)、2017年度江蘇省環(huán)保科研重點(diǎn)項(xiàng)目(2017005)、2017年江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(17)3047)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41771350)和中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)項(xiàng)目(2018350)資助。

yemao@issas.ac.cn；wujun2013@njau.edu.cn)

趙遠(yuǎn)超(1993—)，男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事噬菌體分離純化、定向進(jìn)化及農(nóng)業(yè)噬菌體療法在抗性致病細(xì)菌污染土壤中的靶向滅活研究。E-mail: 2016103027@njau.edu.cn

S154.1；Q938.1+3

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.05.014