趙艷霞，王大紅

（武漢職業(yè)技術學院生物工程學院，湖北武漢430074）

白牛肝菌，又稱美味牛肝菌，是一種味道鮮美、肉厚而細軟的優(yōu)良野生食用菌[1]。白牛肝菌富含蛋白質、維生素、多糖、氨基酸和各種礦質元素，其中白牛肝菌多糖是一類含有多種活性物質的大分子化合物，是由醛糖和酮糖以吡喃糖苷鍵連在一起的多聚物。研究表明白牛肝菌多糖可以提高機體的耐力，具有抗疲勞、抗氧化的功效[2-4]。因此開展與白牛肝菌及其提取物相關的研究，對其進一步的開發(fā)、推廣利用有著深遠的意義。

目前，多糖的傳統(tǒng)提取工藝為乙醇沉淀法[5-7]，此方法雖然能提取出大量的多糖，但是存在提取不徹底，原料利用率低，乙醇用量大等問題。三相萃取法提取多糖可以避免醇沉工藝的缺點，其原理是通過在水提液中加入無機鹽和有機溶劑使其形成三相，上相為有機層，主要是吸附色素、脂類等極性較小的物質，中間相為鹽析形成蛋白質層，下相為水層，主要是溶解一些水溶性物質[8-10]。提取結束后，提取液中的有機溶劑和無機鹽都可回收，是一種綠色高效提取多糖的工藝。本試驗采用叔丁醇-（NH4）2SO4-提取液三相體系萃取白牛肝菌多糖，并通過響應面試驗優(yōu)化提取工藝，并分析白牛肝菌多糖的抗氧化活性，為白牛肝菌的提純和開發(fā)利用提供科學的參考依據，能讓其發(fā)揮最大的市場經濟價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RV10 型旋轉蒸發(fā)儀：德國 IKA 公司；LD-10 型冷凍干燥機：湖南博瑞德生物有限公司；YT-1 型分光光度計：無錫尚科儀器有限公司；TENSOR II 傅里葉變換近紅外光譜儀：德國Bruker Optics 公司。

1.2 材料與試劑

試驗白牛肝菌：當地藥材市場。無水乙醇、叔丁醇、（NH4）2SO4均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白牛肝菌多糖三相萃取工藝流程

白牛肝菌→蒸餾水提取→水提液濃縮→加入（NH4）2SO4、叔丁醇→混勻→靜止萃取→分離、冷凍干燥→白牛肝菌多糖

1.3.2 白牛肝菌多糖三相萃取工藝要點

1）蒸餾水提?。簩?0 g 白牛肝菌按料液比1 ∶30（g/mL）加入蒸餾水，50 ℃水浴 30 min，提取 1次～4 次。

2）水提液濃縮：將提取液在50 ℃條件下旋轉蒸發(fā)，濃縮至100 mL。

3）加入（NH4）2SO4、叔丁醇：在提取液濃縮中加入10%～50%添加量的（NH4）2SO4，再加入 5 mL～25 mL 的叔丁醇，形成三相體系。

4）混勻、靜止萃取：充分混勻后，于 20 ℃～60 ℃條件下靜置萃取60 min。

5）分離、冷凍干燥：萃取后，形成三相，上層為叔丁醇相，主要含有色素、脂類物質、黃酮類；中間相為蛋白質；下層為（NH4）2SO4相，主要含有白牛肝菌多糖，并通過分子透析法除去無機鹽后冷凍干燥得到白牛肝菌多糖。

1.3.3 白牛肝菌多糖提取率的計算

采用苯酚-硫酸法測多糖含量[11-14]，以外標法測定白牛肝菌多糖質量，并計算得到多糖提取率，計算公式如下：

白牛肝菌多糖提取率/%=（白牛肝菌多糖質量/白牛肝菌樣品質量）×100

1.3.4 單因素試驗

稱取10 g 白牛肝菌，以水提法分別提取1、2、3、4次，合并提取液濃縮至100 mL，以三相萃取法提取白牛肝菌多糖，提取濃縮并冷凍干燥后制得白牛肝菌多糖，測定白牛肝菌多糖含量并計算提取率。分別研究（NH4）2SO4添加量 10%、20%、30%、40%、50%，叔丁醇添加量 5、10、15、20、25 mL，萃取溫度 20、30、40、50、60 ℃條件下，對白牛肝菌多糖提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗對白牛肝菌多糖提取條件的優(yōu)化

根據單因素試驗得到的結果，選?。∟H4）2SO4添加量、叔丁醇添加量、萃取溫度3 個因素，采用Designexpert8.0 軟件進行響應面試驗設計[15-19]，試驗因素與水平見表1。

1.3.6 白牛肝菌多糖清除·OH 能力的測定

參照水楊酸法[20]，分別取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL白牛肝菌多糖溶液各2 mL 置于10 mL 的試管中，再加入 2 mL 硫酸亞鐵（0.005 moL/mL）、2 mL H2O2，靜置5.0 min 后，再加入 2 mL 的水楊酸溶液（0.005 moL/mL），在37 ℃溫度下水浴10 min，波長510 nm 條件下測定吸光度X 值。X0為空白對照組的吸光度值，X1為蒸餾水代替白牛肝菌多糖溶液的吸光度值，X2為白牛肝菌多糖溶液的吸光度值，并以VC作為對照組，·OH 清除率計算公式如下所示：

表1 響應面試驗因素水平Table 1 The level of response surface experimental factors

1.3.7 白牛肝菌多糖清除DPPH·能力的測定

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 （NH4）2SO4添加量對白牛肝菌多糖提取率的影響

（NH4）2SO4添加量對多糖得率的影響見圖1。

圖1 （NH4）2SO4 添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effect of（NH4）2SO4 addition on extraction efficiency of polysaccharide

由圖1 可知，開始隨著（NH4）2SO4添加量從 10%增加到30 %時，白牛肝菌多糖的提取率在增加，由35.5%增加至40.9%，這可能是NH4+和SO4+可以穩(wěn)定大分子間的相互作用，使萃取體系更加穩(wěn)定，多糖能更好地溶解在溶劑中；當（NH4）2SO4添加量增加到40%及以后，白牛肝菌多糖的提取率呈減少趨勢，這是由于鹽濃度過高會使多糖和水分子之間的氫鍵作用力被減弱，從而降低了多糖的提取率，因此初步選擇（NH4）2SO4添加量為 10%～30%之間。

2.1.2 叔丁醇添加量對白牛肝菌多糖提取率的影響

叔丁醇添加量對多糖得率的影響見圖2。

圖2 叔丁醇添加量對多糖得率的影響Fig.2 Effect of tert butyl alcohol addition on extraction efficiency of polysaccharide

由圖2 可知，隨著叔丁醇添加量的增加，白牛肝菌多糖的提取率也相應增加，在叔丁醇添加量在5 mL～10 mL 之間，白牛肝菌多糖提取率增加幅度較大，這可能是由于增加叔丁醇和（NH4）2SO4的含量引起相互作用的結果，導致多糖提取率的增加；但是當叔丁醇添加量超過15 mL 后，白牛肝菌多糖的提取率大幅下降，這可能是叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩(wěn)定性，所以初步選擇白牛肝菌多糖的叔丁醇添加量在5 mL～15 mL 之間。

2.1.3 萃取溫度對白牛肝菌多糖提取率的影響

在手機應用、互聯網服務器以及運營商核心網引入網絡狀態(tài)數據的收集、模型運算以及QoS調用的準入功能,能有效確保用戶感知指標,有利于運營商能力開放業(yè)務的順利開展。本文成果主要以手機游戲為應用對象,在移動互聯網中不同

萃取溫度對多糖得率的影響見圖3。

圖3 萃取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction efficiency of polysaccharide

由圖3 可知，當白牛肝菌多糖萃取溫度在20 ℃～40℃之間逐漸增加時，白牛肝菌多糖的提取率由34.3%增加至41.5%，這可能是因為溫度的增加讓三相萃取溶液體系中分子熱運動加快，這樣白牛肝菌多糖更容易從白牛肝菌中進入到萃取溶液中，從而白牛肝菌多糖的提取率增加；當萃取溫度超過40 ℃以后，白牛肝菌多糖的提取率出現下降，這可能溫度增加超過一定范圍后，雖然多糖分子的熱運動速度增加了，但是與其他物質間的反應以及反應速率也在增加，提取出的白牛肝菌多糖顏色也在加深，說明高溫對白牛肝菌多糖的活性也有影響，所以選擇提取溫度20 ℃～40 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.4 水提次數對白牛肝菌多糖提取率的影響

水提次數對多糖得率的影響見圖4。

圖4 水提次數對多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction efficiency of polysaccharide

由圖4 可知，蒸餾水提次數對白牛肝菌多糖的提取率影響不大，在提取1 次～4 次范圍內，多糖提取率都在42%左右波動。提取1 次時，多糖提取率最低，為41.6%；提取4 次時，多糖提取率最高，為42.1%，兩種之間相差不大。從節(jié)約和經濟的角度考慮，將提取次數定為1 次，考慮到提取次數對白牛肝菌多糖提取影響不明顯，故而在響應面試驗中提取次數不作為考察因子進行考慮。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面分析方案和結果Table 2 Program and results of orthogonal test

續(xù)表2 響應面分析方案和結果Continue table 2 Program and results of orthogonal test

由Design-Expert 軟件處理數據，方差分析結果見表3。對響應值與各個因素進行回歸擬合，該模型對應的回歸方程：Y=43.4+1.6A+1.8B+1.2C-0.83AB-1.48AC-0.33BC-2.14A2-7.79B2-4.24C2

回歸方程各項的方差分析見表3。

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3 結果可知，整體模型P 值＜0.01，說明此時回歸方差模型極顯著，該試驗方法可靠。方程失擬項也極顯著，該回歸模型與實測值能較好的擬合。其中A（NH4）2SO4添加量，B 叔丁醇添加量對響應值影響顯著（P＜0.05），B2，C2對響應值影響極顯著（P＜0.01），各個因素對白牛肝菌多糖得率影響大小順序依次為：叔丁醇添加量（B）＞（NH4）2SO4添加量（A）＞萃取溫度（C）。

2.3 響應面直觀分析

Design-Expert 處理得到響應面的分析結果見圖5～圖7。

圖5 （NH4）2SO4 添加量和叔丁醇添加量對多糖提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface methodology for the influence of（NH4）2SO4 addition and tert butyl alcohol addition to materialratio on extraction rate of polysaccharides

圖6 萃取溫度和（NH4）2SO4 添加量對多糖提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of temperature and（NH4）2SO4 addition on the extraction rate of polysaccharides

圖7 萃取溫度和叔丁醇添加量對多糖提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface methodology for the influence of temperature and tert butyl alcohol addition to material ratio on extraction rate of polysaccharides

結果如圖5、圖6、圖7 所示，響應面的直觀分析得到的白牛肝菌多糖最佳提取條件為：（NH4）2SO4添加量30%，叔丁醇添加量10.3 mL，萃取溫度36.8 ℃，理論提取率能達到45.92%。但是考慮到試驗條件的可操作性，將提取條件設定為（NH4）2SO4添加量30%，叔丁醇添加量10 mL，萃取溫度37 ℃，按試驗步驟進行驗證試驗得到的白牛肝菌多糖提取率為47.3%，與上述最優(yōu)值46.4%吻合程度較高，說明了模型的可靠性，證明用響應面優(yōu)化白牛肝菌多糖提取方案具有一定的實際應用價值。

2.4 紅外光譜

白牛肝菌多糖的紅外光譜圖，見圖8。

圖8 白牛肝菌多糖的紅外光譜圖Fig.8 The infrared spectrogram of Boletus boletus polysaccharides

白牛肝菌多糖的紅外光圖譜顯示，在3 420 cm-1附近的強吸收峰是糖類分子間或分子內的O-H 鍵伸縮振動，在1 612 cm-1附近為羧基的C=O 伸縮振動，1 073 cm-1附近的強吸收峰是糖苷鍵C-O-C 非對稱伸縮振動，屬于吡喃環(huán)上的醚鍵特征吸收峰，說明白牛肝菌多糖中存在吡喃糖苷鍵。

2.5 白牛肝菌多糖清除·OH以及DPPH·的能力

白牛肝菌多糖清除·OH 以及DPPH·的能力見圖9～圖10。

圖9 白牛肝菌多糖對·OH 的清除作用Fig.9 Scavenging effect of Boletus boletus polysaccharide on·OH

圖10 白牛肝菌多糖對DPPH·的清除作用Fig.10 Scavenging effect of Boletus boletus polysaccharide on DPPH·

由圖9、圖10 可知，白牛肝菌多糖對·OH 清除率以及DPPH·清除率隨白牛肝菌多糖濃度增加而增大，這兩種自由基清除率越高說明白牛肝菌多糖的抗氧化能力就越強，白牛肝菌多糖對·OH 的半數清除率IC50值為2.5 mg/mL，對DPPH·清除率的半數清除率IC50值能達到11.6 mg/mL，說明白牛肝菌多糖對羥基自由基以及DPPH·都有很強的清除能力，也說明此三相萃取法工藝能夠很好地保存了白牛肝菌多糖的活性。

3 結論

本試驗以白牛肝菌為原料，利用三相萃取法提取白牛肝菌多糖，優(yōu)化提取工藝。經過單因素試驗以及響應面試驗優(yōu)化后，最佳提取工藝為（NH4）2SO4添加量為30%，叔丁醇添加量為10 mL，萃取溫度為37 ℃，提取次數1 次，此工藝條件下白牛肝菌多糖的提取率能達到47.3%。白牛肝菌多糖的·OH 和DPPH·清除能力試驗表明，白牛肝菌多糖對兩者均具有很強的清除能力，說明白牛肝菌多糖具有一定的抗氧化能力，三相萃取法工藝也很好地保存了白牛肝菌多糖的活性。這為以后將白牛肝菌多糖開發(fā)成為具有抗疲勞、抗氧化、增強免疫功能的保健功能食品，提供一定的科學依據和研究基礎。