何文婷　翟云蘭　張洪亮

摘要：目前臨床在診療過程中，無活檢組織樣本的情況下，常規(guī)使用液體活檢檢測(cè)腫瘤敏感靶點(diǎn)以尋找敏感靶向藥。而最新研究中液體活檢計(jì)算的腫瘤突變負(fù)荷（bTMB）可以對(duì)PD-1/L1抑制劑進(jìn)行療效預(yù)測(cè);同時(shí)越來越多的研究發(fā)現(xiàn)液體活檢可以通過對(duì)腫瘤分子負(fù)荷進(jìn)行檢測(cè)分析，用于腫瘤的預(yù)后評(píng)估，微小殘留病灶監(jiān)測(cè)，以及腫瘤的克隆進(jìn)化分析，這使得液體活檢有望在腫瘤診療過程中輔助臨床進(jìn)行更全面的監(jiān)測(cè)管理，本文就此做一綜述。

關(guān)鍵詞：液體活檢;腫瘤;ctDNA;液體監(jiān)測(cè)

中圖分類號(hào)：R730.43 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.010

文章編號(hào)：1006-1959（2019）19-0029-03

Application of Liquid Biopsy in Tumor Monitoring and Management

HE Wen-ting1，ZHAI Yun-lan2，ZHANG Hong-liang1

（1.Department of tumor，Subject Two，Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine，

Urumqi 830000，Xinjiang，China;

2.Beijing Jiyinjia Technology Co.，Ltd.，Beijing 102200，China）

Abstract：At present， in the clinical diagnosis and treatment process， without biopsy tissue samples， routine use of liquid biopsy to detect tumor-sensitive targets to find sensitive targeted drugs. The tumor mutation load （bTMB） calculated by liquid biopsy in the latest study can predict the efficacy of PD-1/L1 inhibitors. At the same time， more and more studies have found that liquid biopsy can be used for tumor analysis by analyzing tumor molecular load. Prognostic assessment， micro-residual lesion monitoring， and clonal evolution analysis of tumors make liquid biopsy promising for more comprehensive monitoring and management during tumor diagnosis and treatment. This article reviews this issue.

Key words：Liquid biopsy;Tumor;ctDNA;Fluid monitoring

2012年，研究者首次發(fā)現(xiàn)Nivo單抗可使非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者從中獲益，目前免疫治療已經(jīng)成為腫瘤治療最具希望的治療方式，腫瘤成為慢性病或許成為可能[1]。受腫瘤自身的特點(diǎn)和目前的臨床診療限制，70%的肺癌患者在初診之時(shí)已屬晚期狀態(tài)，無法獲得足夠的組織用于檢測(cè)[2]。在治療過程中，由于腫瘤的時(shí)空異質(zhì)性，需要進(jìn)行不同部位、不同治療節(jié)點(diǎn)的多次基因信息檢測(cè)，在臨床上需進(jìn)行更加精準(zhǔn)的治療。目前臨床通過影像學(xué)和/或腫標(biāo)進(jìn)行腫瘤監(jiān)測(cè)/療效評(píng)價(jià)，但存在靈敏度和特異性不足的問題，而且單從影像學(xué)和腫標(biāo)的療評(píng)結(jié)果只能判斷病情進(jìn)展，卻無法得知疾病進(jìn)展的真正原因。循環(huán)游離DNA（cfDNA）是血液中細(xì)胞成分之外的小片段DNA，由細(xì)胞凋亡或壞死后釋放入血，腫瘤所釋放的DNA稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），是cfDNA的一部分，ctDNA的含量占比與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，被形象的比喻為“分子聽診器”，因此基于外周血的液體活檢具有檢測(cè)標(biāo)本易獲取的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，或許能夠輔助臨床獲取一些分子層面的疾病進(jìn)展原因。除了代替組織樣本檢測(cè)和評(píng)效之外，液體活檢ctDNA在腫瘤早篩、疾病分型、治療決策、療效監(jiān)測(cè)、腫瘤異質(zhì)性分析、耐藥分析等方面都有研究應(yīng)用探索[3]。目前液體活檢腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用包括靶點(diǎn)檢測(cè)，預(yù)測(cè)靶向藥物療效，計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷（TMB），預(yù)測(cè)PD-1/L1抑制劑療效，監(jiān)測(cè)分子腫瘤負(fù)荷，克隆進(jìn)化分析等，本文對(duì)液體活檢檢測(cè)腫瘤的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1靶點(diǎn)檢測(cè)

目前針對(duì)靶點(diǎn)檢測(cè)，有多個(gè)基因檢測(cè)的平臺(tái)并有多種方法可以選擇，且各有優(yōu)勢(shì)。DHPLC法對(duì)晚期NSCLC患者行EGFR基因突變檢測(cè)，靈敏度3%，該檢測(cè)方法獲得歐盟認(rèn)證;ARMS檢測(cè)因檢測(cè)靈敏度高、儀器設(shè)備要求低、操作流程及數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單，且CSCO肺癌診療指南作為Ⅰ類證據(jù)推薦采用ARMS方法行EGFR基因突變檢測(cè)，2014年以后將檢測(cè)技術(shù)更換為靈敏度相對(duì)高的ARMS法;微滴數(shù)字PCR技術(shù)，其靈敏度相對(duì)更高，目前僅用于科研;二代測(cè)序技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多基因平行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度由測(cè)序深度決定，既往文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)測(cè)序深度達(dá)1×104時(shí)，其EGFR基因突變檢測(cè)靈敏度0.2%[4]。目前，常用的平臺(tái)為CSCO指南推薦的ARMS檢測(cè)或數(shù)字PCR檢測(cè)，特別是隨著NGS檢測(cè)技術(shù)的興起和發(fā)展，NCCN、CSCO指南建議臨床也選擇NGS panel檢測(cè)，其血漿檢測(cè)檢出限低，組織和血漿檢測(cè)一致性高，一次檢測(cè)多基因以篩選更多獲益患者。

Wang Z等[5]的研究提示血漿ctDNA檢測(cè)可精準(zhǔn)指導(dǎo)靶向治療，使用多基因NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除了EGFR突變，同時(shí)伴隨存在驅(qū)動(dòng)或抑癌基因突變檢出，會(huì)導(dǎo)致TKI獲益時(shí)間縮短，提示治療療效不佳。在治療過程中，EGFR敏感突變的存在與否也可以提示治療的預(yù)后。有研究對(duì)比了4種血漿ctDNA檢測(cè)T790M的平臺(tái)，以cobas組織檢測(cè)作為參照，NGS血漿T790M檢測(cè)顯示出較高的敏感性和一致性[6，7]。NGS檢測(cè)指導(dǎo)精準(zhǔn)治療，療效分析結(jié)果顯示，ctDNA液體活檢在靶點(diǎn)檢測(cè)、預(yù)測(cè)藥物療效方面具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

因此液體活檢技術(shù)的應(yīng)用里，敏感靶點(diǎn)的檢測(cè)已經(jīng)成為臨床常用的技術(shù)，同時(shí)NGS檢測(cè)在所有液態(tài)活檢技術(shù)里具有更多的臨床意義，可以做多基因panel檢測(cè)，在尋找敏感靶點(diǎn)的同時(shí)，排查耐藥突變以及檢測(cè)伴隨突變，對(duì)靶向藥的療效可以在分子層面做出一定的療效預(yù)估。

2計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷

多個(gè)癌種的綜合研究發(fā)現(xiàn)TMB跟免疫療效成正比，TMB一般以腫瘤非同義突變總數(shù)量或每1Mb堿基的突變數(shù)量來表示。雖然，從突變到產(chǎn)生新抗原的每一步都有較大折損，但理論上：TMB越高，最后能夠被T細(xì)胞識(shí)別的新抗原產(chǎn)生也越多，對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑可能更敏感[8，9]。對(duì)于TMB<1 Mb的腫瘤患者幾乎不可能產(chǎn)生新抗原，對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑不敏感[10]?；谀[瘤組織的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）已被論證與惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、尿路上皮癌等多個(gè)實(shí)體瘤的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICB）單藥療效正相關(guān)。然而，在臨床上多數(shù)患者并沒有足量的腫瘤組織標(biāo)本做TMB檢測(cè)。此基于血液樣本檢測(cè)TMB（bTMB），并以此進(jìn)行療效預(yù)測(cè)，有待于展開進(jìn)一步的探索研究。目前雖然國(guó)際上對(duì)TMB cut-off值的標(biāo)準(zhǔn)還未確定[11]，但是研究者們已經(jīng)根據(jù)各自的NGS檢測(cè)芯片以及檢測(cè)方法得出了多個(gè)cut-off值，而這些cut-off值無論是10、16還是20，都可以看到顯著的中位生存期（PFS）和總生存期（OS）的獲益。同時(shí)因活檢組織經(jīng)常難以獲得，目前也在使用液體活檢獲得TMB值（bTMB），從研究結(jié)果可以看到bTMB≥16且PD-L1表達(dá)>50%的患者從Atezolizumab的治療中獲益最多。在bTMB≥16的人群中，PFS HR為0.57（95%CI： 0.33～0.99），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中位PFS分別為4.2個(gè)月和2.9個(gè)月，HR為0.57（95%CI：0.33～0.99），中位OS分別為13.0個(gè)月和7.4個(gè)月。由于bTMB≥16組觀察到了更優(yōu)的PFS獲益，最終選擇了16為cut-off值。進(jìn)一步擴(kuò)大患者人群驗(yàn)證也得到同樣的結(jié)論。在bTMB≥16人群中，研究顯示PFS和OS獲益顯著，PFS HR為0.65（95%CI：0.47～0.92），OS HR為0.64（95%CI：0.44～0.92），進(jìn)一步確定了16是bTMB預(yù)測(cè)Atezolizumab療效合適的cut-off值[12]。

在2019年NCCN指南中建議進(jìn)行TMB檢測(cè)，篩選免疫治療獲益患者。但是，其評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)尚未達(dá)成共識(shí)。Büttner R等[13]總結(jié)了目標(biāo)區(qū)域檢測(cè)計(jì)算TMB值需要參考的一些因素，首先是樣本類型，建議優(yōu)先選用組織樣本;檢測(cè)基因的目標(biāo)區(qū)域應(yīng)>0.8 Mb（最好>1 Mb），以確保TMB值的可靠性;對(duì)于目標(biāo)區(qū)域檢測(cè)得到的TMB值，另外還需要與WES檢測(cè)得到的TMB結(jié)果做一致性分析;但是cut-off值目前尚無標(biāo)準(zhǔn)，需要與免疫抑制劑臨床療效數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)進(jìn)行確定。

3分子腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)

已有研究表明，ctDNA水平與腫瘤分期、腫瘤體積大小、轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)及治療都有關(guān)，可以反映腫瘤負(fù)荷，即“分子CT”[14]。在肝癌的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小與ctDNA和腫標(biāo)相比，相關(guān)性更強(qiáng)。在肺癌中發(fā)現(xiàn)，ctDNA可以提示腫瘤預(yù)后，高ctDNA水平與預(yù)后差相關(guān)，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中也是如此，并且比腫標(biāo)有更高的靈敏性[15，16]。

Abbosh C等[15]的研究選擇40例肺癌患者和54名健康成人的255個(gè)樣本進(jìn)行研究，在94%經(jīng)歷復(fù)發(fā)的可評(píng)估患者中，ctDNA在第一次治療后血液樣本中被檢測(cè)到，表明ctDNA可評(píng)估術(shù)后微小殘留病灶（MRD）。治療后ctDNA檢測(cè)，在72%的患者中進(jìn)行放射學(xué)檢查，中位數(shù)為5.2個(gè)月，53%的患者攜帶與酪氨酸激酶抑制劑或免疫檢查點(diǎn)阻滯有利反應(yīng)相關(guān)的ctDNA突變譜，可從靶向治療和免疫治療中獲益?；顧z液體可以準(zhǔn)確地檢測(cè)肺癌患者的ctDNA MRD，同時(shí)為患者提供個(gè)性化治療參考。另有研究顯示，女性早期乳腺癌患者在新輔助治療后手術(shù)，監(jiān)測(cè)術(shù)后ctDNA的有無評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后ctDNA與腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)，提示術(shù)后ctDNA可以監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Raja R 等[17]的研究顯示，93%肺癌患者在監(jiān)測(cè)過程中出現(xiàn)ctDNA陽性（2個(gè)以上SNV）其中3例患者，輔助化療前后，血漿檢出SNV數(shù)目上升，且均在術(shù)后一年出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，提示ctDNA 分析能夠反映輔助化療耐藥，且與腫瘤療效和復(fù)發(fā)相關(guān)?；颊咝g(shù)前50天進(jìn)行PET檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)腦部病灶;術(shù)后血漿中有ctDNA檢出;術(shù)后54天，臨床確診腦部轉(zhuǎn)移，無其他病灶。該結(jié)果提示ctDNA較影像學(xué)更靈敏，可能更早提示復(fù)發(fā)。使用durvalumab治療的肺癌患者研究顯示[18，19]，用藥后6周ctDNA水平降低的患者腫瘤體積變小、治療獲益時(shí)間長(zhǎng)，提示ctDNA水平與免疫治療療效相關(guān)，ctDNA可監(jiān)測(cè)免疫治療效果。

4克隆進(jìn)化分析

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往伴隨著新突變的產(chǎn)生和原有突變的積累。從進(jìn)化角度上來看，越早發(fā)生的突變，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的位置就越靠近主干，相反，越晚發(fā)生的突變則位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支。通常情況下，組織活檢，檢出的是區(qū)域性的亞克隆群體。而血漿ctDNA中則涵蓋了腫瘤組織中不同的克隆DNA片段，從而可以反映不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)腫瘤克隆組成的動(dòng)態(tài)變化[20]。因此，血漿ctDNA檢測(cè)，可用于研究腫瘤克隆進(jìn)化和耐藥克隆的發(fā)生、發(fā)展。

在不同癌種的不同治療階段過程中，可能出現(xiàn)癌種特異和階段特異的驅(qū)動(dòng)突變，但不同癌種間也存在共同的驅(qū)動(dòng)事件[21]。Wang Z等[5]研究顯示，吉非替尼治療開始后，第8周EGFR突變消失的患者預(yù)后好，說明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EGFR突變有助于預(yù)測(cè)預(yù)后;血漿出現(xiàn)獲得性T790M 突變的中位時(shí)間為7.6月（95%CI：6.0～10.0）。從T790M陽性至疾病進(jìn)展的中位時(shí)間為2.0月（95%CI：2.0～4.9）。關(guān)于臨床該何時(shí)更改治療方案，已有Remon J等[22]的研究對(duì)比了吉非替尼治療EGFR陽性患者分別在影像學(xué)和ctDNA提示PD時(shí)，更換治療方案比較其獲益時(shí)間，目前研究還在進(jìn)行中，結(jié)果尚不清楚。

綜上所述，液體活檢目前主要應(yīng)用在于：靶點(diǎn)檢測(cè)、靶向藥物療效預(yù)測(cè)、TMB、預(yù)測(cè)PD-1/L1抑制劑療效、評(píng)估腫瘤預(yù)后、微小殘留病灶MRD和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)分子腫瘤負(fù)荷、克隆進(jìn)化分析等方面。基于目前臨床通過影像學(xué)、腫標(biāo)進(jìn)行腫瘤監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)存在靈敏度和特異性不足的問題，液體活檢通過其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在腫瘤的全病程管理中起到協(xié)助臨床的作用，幫助臨床進(jìn)行精準(zhǔn)診療。

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