霍曉奎　王長遠(yuǎn)

摘要：目的 ?建立一種高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）測定人血漿鹽酸偽麻黃堿濃度的方法。方法 ?血漿樣品經(jīng)液液萃取后，以甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）為流動相，流速0.35 ml/min，采用Cap cell pack C18色譜柱分離，150 mm×2.1 mm， ? ? 5 μm（USA）;柱溫20℃，選擇離子噴霧離子化源串聯(lián)質(zhì)譜，通過正離子方式檢測;選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式轉(zhuǎn)化m/z=166.3/148.2（鹽酸偽麻黃堿）和m/z= 152.2/134.15（內(nèi)標(biāo)苯丙醇胺）進(jìn)行定量分析，用內(nèi)標(biāo)法測定含量。結(jié)果 ?偽麻黃堿濃度分別在5.0～400.0 ng/ml的范圍內(nèi)線性良好，R=0.9962，最低檢測限為1.0 g/ml。結(jié)論 ?本方法操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于該藥物的含量測定，同時也可為臨床藥動學(xué)研究提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：偽麻黃堿;LC-MS/MS;血藥濃度;藥代動力學(xué)

中圖分類號：R969.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.054

文章編號：1006-1959（2019）19-0163-03

Determination of Pseudoephedrine Hydrochloride in Human Plasma by High Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUO Xiao-kui，WANG Chang-yuan

（School of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，Liaoning，China）

Abstract：Objective ?To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS） method for the determination of pseudoephedrine hydrochloride in human plasma.Methods ?After the liquid sample was extracted by liquid-liquid extraction， the mobile phase was methanol：water：formic acid （60∶40∶1， V/V/V）， the flow rate was 0.35 ml/min， and separated by Cap cell pack C18 column， 150 mm×2.1mm，5 μm （USA）; column temperature 20°C， selective ion spray ionization source tandem mass spectrometry， positive ion detection; selective reaction monitoring （MRM） conversion m/z=166.3/148.2 （pseudoephedrine hydrochloride） and m/z=152.2/134.15 （internal standard phenylpropanolamine） for quantitative analysis， content determined by internal standard method.Results ?The pseudoephedrine concentration was linear in the range of 5.0～400.0 ng/ml，R=0.9962， and the minimum detection limit was 1.0 g/ml.Conclusion ?The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of the drug content. It can also provide a reference for clinical pharmacokinetic studies.

Key words：Pseudoephedrine;LC-MS/MS;Blood concentration;Pharmacokinetics

麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿成分為擬腎上腺類藥物，是國家規(guī)定的需要嚴(yán)格控制的毒、麻類成分，鹽酸偽麻黃堿有收縮上呼吸道血管的作用，可以用于鼻黏膜水腫的治療，配伍使用抗組胺藥，可用于過敏性鼻炎和感冒等的治療。建立鹽酸偽麻黃堿的含量測定方法具有重要的意義。目前鹽酸偽麻黃堿的含量測定以高效液相色譜法為主，但該法存在檢測靈敏度低，檢測時間長等缺點。本研究建立了一種高效液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用法測定鹽酸偽麻黃堿的含量，此方法簡便、易行，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，可為鹽酸偽麻黃堿含量測定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考，同時也可為臨床藥動學(xué)研究提供一定的參考，現(xiàn)介紹如下。

1儀器與試藥

1.1儀器 ?Agilent 1200液相色譜儀，Applied Biosystems公司API3200型質(zhì)譜儀，德國FLOM公司FCR 2002-UF型純水機(jī)，德國Thermo公司ST-16R型高速離心機(jī)。

1.2試藥 ?鹽酸偽麻黃堿對照品，由中國生物制品檢驗鑒定所提供，含量99.8%;苯丙醇胺對照品（內(nèi)標(biāo)物，含量99.8%，100217-200303），由中國生物制品檢驗鑒定所提供，甲醇為色譜純，購自Fisher試劑公司。其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件 ?色譜柱為Cap cell pack C18，150 mm×2.1 mm，5 μm（USA）;流動相為甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）;流速為0.35 ml/min;柱溫為20℃。離子源為ESI源;噴射電壓（IS）5.5 kV;溫度（TEM）650;鞘氣（N2）流量（GAS 1）40 psi;輔助氣（N2）流量（GAS 2）35 psi;氣簾氣（CUR）10 psi;去簇電壓（DP）26 eV（鹽酸偽麻黃堿）和26 eV（內(nèi)標(biāo)）;碰撞電壓CE17 eV（鹽酸偽麻黃堿）和17 eV（內(nèi)標(biāo)）;正離子方式檢測：掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，選擇的離子反應(yīng)m/z=166.3/148.2（鹽酸偽麻黃堿）和m/z=152.2/134.15（內(nèi)標(biāo)苯丙醇胺）進(jìn)行定量分析，一次進(jìn)樣，雙通道檢測。

2.2溶液的制備 ?精密稱取對照品（鹽酸偽麻黃堿）5.0 mg和內(nèi)標(biāo)（苯丙醇胺）對照品3.0 mg，分別置于250 ml量瓶中，加水∶甲醇（50∶50，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻后得到母液。實驗前用甲醇水稀釋成所需標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3血漿樣品處理 ?取血漿0.5 ml，置10 ml具塞試管中，依次加入水100 μl，內(nèi)標(biāo)溶液（400 ng/ml苯丙醇胺水溶液）100 μl，2 mol/L NaOH 溶液100 μl。渦流30 s。加提取溶劑甲基叔丁基醚3 ml，渦流15 s，往復(fù)震蕩10 min，3000 r/min離心10 min。分取上層有機(jī)相2 ml于40℃水浴中空氣流下吹干，殘留物加200 μl流動相溶解，取20 μl進(jìn)樣。

2.4方法專屬性 ?在上述方法條件下，待測組分無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，待測物與內(nèi)標(biāo)峰形良好，鹽酸偽麻黃堿與苯丙醇胺的保留時間分別為1.29 min和1.25 min，色譜圖見圖1。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 ?在空白血漿中加入鹽酸偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成濃度為5.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線用血漿樣品，按“2.3”中方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積比值為縱坐標(biāo)，用Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.0273x+0.0398（r=0.9962）（n=3）。線性范圍：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，鹽酸偽麻黃堿在5.0～400.0 ng/ml的范圍內(nèi)線性良好，定量下限為1.0 g/ml。

2.6方法回收率及精密度 ?按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”操作，制備鹽酸偽麻黃堿次低、中、次高三個濃度（分別為10、40、200 ng/ml）的樣品，5個樣本，分別在同一天內(nèi)測定5次和每天一次測定5天，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

3討論

鹽酸偽麻黃堿作為復(fù)方成分廣泛用于感冒藥中，用于減輕感冒癥狀。由于添加劑量一般較小，在人體內(nèi)濃度較低。偽麻黃堿的血藥濃度測定方法有很多種，尤其以高效液相色譜法較常見，但該法測定難度極大，分析時間長，并且靈敏度不高。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展， LC-MS/MS技術(shù)在血藥濃度的測定中被廣泛應(yīng)用。在流速的考察中，選擇0.2 ml/min、0.35 ml/min、0.5 ml/min等多個流速對鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.35 ml/min峰型最好，故最終流速選擇0.35 ml/min;在檢測模式的選擇上，本研究分別考察了正離子和負(fù)離子的檢測方式，發(fā)現(xiàn)正離子檢測方式的靈敏度明顯高于負(fù)離子的檢測方式，因此選擇了正離子模式;在樣品處理環(huán)節(jié)中，考察了蛋白沉淀法和固相萃取法，結(jié)果顯示蛋白沉淀法存在基質(zhì)效應(yīng)，影響測定的靈敏度和準(zhǔn)確度，固相萃取法因提取回收率過低和價格高的原因被放棄，最終選擇液液萃取的方法。

本研究采用LC-MS/MS測定人血漿鹽酸偽麻黃堿的濃度，并采用液液萃取的方法處理樣品。成功的凈化了基質(zhì)，排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，且分析快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)。日內(nèi)、日間精密度及回收率等相關(guān)實驗數(shù)據(jù)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。該測定血漿中的鹽酸偽麻黃堿的方法符合有關(guān)規(guī)范要求，可用于藥物代謝動力學(xué)試驗。

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