白霄霞 沈風嬌 李志斌 趙建成 蔣淑磊 石碩

摘 ? ?要：杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物作為重要觀賞和中藥植物，市場前景廣闊，發(fā)展?jié)摿薮?。本文通過歸納杜鵑花屬植物的分類、鑒定相關問題，發(fā)現利用DNA條形碼可有效解決杜鵑花屬植物（品種）的鑒定問題?；诙霹N花屬植物的具體情況，本文對序列參考數據庫建設、分子標記開發(fā)以及杜鵑花品種的野生親本溯源三方面內容進行綜述，并結合GenBank中1 311條杜鵑花屬DNA序列及作者測序獲得的463條序列，初步建立杜鵑花屬DNA條形碼數據庫，并通過非加權組平均法利用matK與psbA-trnH序列聯(lián)合建立UPGMA樹，部分杜鵑花屬栽培品種可與野生種聚為一支。綜合說明DNA條形碼技術可用于對杜鵑花屬栽培品種開展初步的野生親本溯源。

關鍵詞：杜鵑花; DNA條形碼;中國珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺

中圖分類號：S685.21; Q941+1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.001

Abstract： Genus Rhododendron is a group of important ornamental plants and traditional Chinese medicine resources with broad market prospects. In this paper， a DNA barcoding method for effectively solve species （cultivars） identification problems was proposed based on the review of taxonomy and identification history of genus Rhododendron. Three key topics related to DNA barcoding research on genus Rhododendron， which included reference library construction， molecular markers screening and optimization， and cultivars wild relatives tracing， were discussed. The DNA barcodes database of genus Rhododendron was preliminarily constructed with 1 311 DNA sequences in GenBank and 463 sequences generated by the authors. The UPGMA tree was constructed by matK and psbA-trnH sequences， and some cultivated varieties could be grouped with the wild species. The results suggested that DNA barcoding could be used to carry out preliminary wild relatives tracing of cultivated Rhododendron varieties.

Key words： Rhododendron L.; DNA barcoding; BREP

杜鵑花多指杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物——《中國植物志》[1]和《中國植物志》（英文版）[2]中記錄本屬中文名為“杜鵑屬”，但由于杜鵑花的中文名來自杜鵑鳥[3]即動物界中的杜鵑屬（Cuculus L.， Cuculidae），為避免與動物學之“杜鵑”相混淆，此處參考耿玉英[3]的處理，將表示植物的“杜鵑”后面加一“花”字，用中文名“杜鵑花屬”將植物杜鵑與動物杜鵑相區(qū)別。

杜鵑花屬最初由林奈在1753年建立[4]，其學名Rhododendron來源于希臘語，由rhodon（玫瑰）和dendron（樹）組合而來，字面上的意思是“玫瑰樹”[5]。杜鵑花屬包含約1 000個野生種，雖然不同學者對于具體數字觀點不一[1-3，6-8]，但都承認它是種子植物中少見的大屬。權威的植物學名數據庫The Plant List統(tǒng)計了杜鵑花屬下物種水平名稱共計2 506個（包含雜交種），其中741個為接受名稱，850個為異名，另有915個名稱的地位待定（有待進一步分類研究）[7]，可見野生杜鵑花屬植物在物種水平的多樣性非常豐富。杜鵑花的品種數目則更多，其國際品種登陸權威（the International Cultivar Registration Authority for the genus Rhododendron）收錄了上萬個杜鵑花品種[9]。相對如此豐富的物種和栽培品種，最初西方對杜鵑花的分類學研究和物種描述使用的材料卻僅來自于部分模式標本和少量被引種到西方栽培的植株，因此當時對可利用的分類關鍵性狀掌握并不完善;且由于杜鵑花在野外極易產生各種變異并伴有雜交，不同學者對于杜鵑花的分類存在較多爭議[1-3，6，10]。面對物種數量如此之多，而且栽培品種的性狀變異極其復雜的類群，僅依據形態(tài)性狀進行物種和品種的分類尚存較多問題;而且形態(tài)學鑒定需要長期的研究基礎和經驗，面對植物分類鑒定專業(yè)人才缺失的現狀，杜鵑花及其品種的鑒定問題將成為制約相關研究和產業(yè)發(fā)展的瓶頸。如今，在分類研究中注重居群內變異的觀察和體現居群概念的標本館標本研究[11]等方面工作，以進一步加深對杜鵑花屬植物形態(tài)和變異的理解，這將有利于杜鵑花分類問題的更好解決。但更值得注意的是，引入分子生物學數據可以為杜鵑花分類研究提供分子層面數據，基于這些數據進行的分子系統(tǒng)學研究為杜鵑花分類研究開拓了新的局面[12-19]。在對杜鵑花屬分類和分子系統(tǒng)學研究的基礎上，杜鵑花分子鑒定應運而生[20-28]，特別是利用分子標記鑒定物種的DNA條形碼技術。DNA條形碼技術也許可以為杜鵑花物種和品種鑒定難題提供一個可行的、穩(wěn)定的、高效的解決方案。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術，或稱條形碼分子鑒定，是利用基因組中一段“短的”、“標準”的DNA片段來區(qū)分與鑒定生物物種的技術方法[29]。其名稱來源于類似超市商品上的條形碼——每一種商品的包裝上都有代表這一商品信息的條形碼，而這樣的條形碼在同種商品間是一致的，不同商品間卻絕不相同，通過掃描條碼并與數據庫中對應的信息比對，即可以確定這個條形碼對應的是哪種商品。所以DNA條形碼鑒定的基本原理是：每個物種都有不同于其他物種的特有DNA序列;測定樣本的這段特定DNA序列，并與相應的參考序列庫（Library）進行比對，根據被測樣品與參考序列庫序列的相似性便可以將被測樣本鑒定至不同物種。Ratnasingham等[30]研究表明，上述鑒定過程基本上是可行的。

作為21世紀新興的技術之一，DNA條形碼技術不僅對傳統(tǒng)物種分類鑒定給予強有力的補充，而且它采用數字化形式，可以實現樣本鑒定過程自動化和標準化，突破了對操作者經驗的過度依賴，具有快速、高效、可靠、操作性強等特點，能夠在較短時間內建立易于應用的物種鑒定系統(tǒng)。但是，DNA條形碼技術尚存一些問題有待解決。第一，在DNA條形碼鑒定時，需要在數據庫中進行比較、搜索，而這個序列參考數據庫必須在鑒定之前建設完備。只有參考序列庫相對完善，其中囊括了相關的所有物種，并對于每一物種有很好的代表（且物種間的分子序列差異明顯大于物種內差異），才有可能進行分子鑒定，所以建立完善的DNA形碼參考序列庫是影響DNA條形碼應用的一個關鍵問題。第二，用以鑒定的分子標記（Marker），即基因組上特定位置DNA序列，是否具有變異性且易于擴增，直接決定著DNA條形碼是否能夠獲取，影響著DNA條形碼鑒定是否可以進行，所以分子標記的開發(fā)與優(yōu)化是影響DNA條形碼應用的另一個關鍵問題。第三，具體到眾多栽培杜鵑花的鑒定研究，不可避免地涉及到栽培品種來源問題，特別是不同野生種通過雜交參與栽培品種形成。所以利用DNA條形碼追溯杜鵑花品種的野生親本與鑒定杜鵑花品種是不分割的一個問題的兩個方面。綜上所述，結合杜鵑花屬植物具體情況和作者團隊的工作，本文對杜鵑花屬植物DNA條形碼研究需要解決的序列參考數據庫建設、分子標記開發(fā)以及對杜鵑花品種的野生親本溯源三方面內容進行綜述，旨在為杜鵑花資源的利用、育種與開發(fā)提供參考。

1 參考序列庫（Reference library）

1.1 參考序列庫的定義

參考序列庫是對有代表性的、已被準確鑒定的不同物種，以及同一物種的不同個體的DNA條形碼獲取和匯總，序列庫中某一物種的數據是代表這一物種的標準DNA條形碼合集。這樣的參考序列庫保存了某一類生物具有代表性的條形碼序列集，可以用于鑒定這一類生物的不同物種。

1.2 建設參考序列庫要解決的關鍵問題

要保證DNA條形碼鑒定的可操作性，必須有完善的參考序列庫，而參考序列庫的標本都應當來自于被準確鑒定的物種（品種），只有來自準確鑒定標本的參考序列庫條形碼才是可以用于分子鑒定的“合格”條形碼，所以對序列庫收錄杜鵑花物種和品種的準確鑒定是建設參考序列庫的一個關鍵問題。此外，還要考慮用于建設DNA條形碼庫的樣品代表性，即某杜鵑花品種的參考序列來源植物應具代表性，需要采集這一品種一定數量的不同（分布區(qū)）個體，這是建設參考序列庫的另一關鍵問題。

1.3 已有的研究基礎

對于杜鵑花的研究來說，如今可以直接使用的參考序列庫數據主要來自以下網上平臺：GenBank是由美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）組織建立的DNA（及蛋白質）序列數據庫，其開放數據可供各國科學家免費下載使用。截止到2017年11月15日，GenBank數據庫[31]共有杜鵑花屬植物9 298條核酸序列，已經覆蓋了567個物種。BOLD是專業(yè)的DNA條形碼數據網站（Barcoding of Life Data Systems），其中整理和保存了杜鵑花屬植物247個種的條形碼數據，可供DNA條形碼鑒定參考。我國的相關研究起步較晚，以科技部基礎性工作專項“重要生物DNA條形碼的技術規(guī)范體系與信息系統(tǒng)構建”為基礎構建的我國珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺BREP （Barcode of Rare and Endangered Plant，http：//www.brep.ac.cn），提供了準確鑒定我國珍稀瀕危植物及其相關類群的DNA條形碼參考序列[32]。雖然上述數據庫可初步作為杜鵑花植物DNA條形碼的參考序列庫，但其包含物種數距離杜鵑花屬上千個物種的數目尚有一定距離。同時，GenBank數據庫的序列提交幾乎是完全開放的，數據的可靠性不能夠完全保證，如果缺乏分類學者對所研究標本的鑒定和把關，上傳的序列可能是形態(tài)性狀相似的近緣種的錯誤鑒定，如果錯誤鑒定的物種收錄進參考序列庫，將對后期的應用鑒定造成致命影響;BREP包含的數據相對較少，且多針對珍稀瀕危植物進行研究;BOLD的杜鵑花數據庫中多數種只有一兩條參考序列，這距離同一種要有多數代表樣品的要求來說還差得遠[33]。因此，為了達到較好的分子鑒定效果，還需要加大力度建設杜鵑花的參考序列庫：一方面，在生產新的DNA條形碼數據時，要盡量吸收專業(yè)分類鑒定學者參與，確保所使用的標本被盡量準確鑒定，同時，對開放平臺上的序列數據謹慎使用，以寧可不用、不可錯用的原則，利用分子數據分析手段排除可能的錯誤鑒定樣品;另一方面，新建設的序列庫需要覆蓋到盡量多的野生種和栽培品種，并力求同一種或品種都有不同遺傳背景代表的一定數目的個體。

本研究對GenBank等數據庫上相關序列進行了下載、分析、優(yōu)化與整合，初步建立可用于鑒定杜鵑花的分子參考序列庫。同時，依托現有的“高山杜鵑”及其他杜鵑花品種收集，對62個品種（個體）116號標本進行DNA條形碼研究和品種序列基礎庫建設，對不同樣品的rbcL、matK、trnH-psbA和ITS共4個序列完成了擴增和測序，已經初步建立本地的杜鵑花品種分子鑒定參考序列庫（表1）。今后我們計劃與各標本館合作，利用標本館已經相對準確鑒定過的植物標本的分子材料，進行數據生產。在收集較豐富的標本樣品后，可利用二代測序技術批量獲取可用的參考序列，為建設杜鵑花植物DNA條形碼鑒定參考序列庫提供第一手數據。

2 分子標記

2.1 DNA條形碼研究中的分子標記

在DNA條形碼研究中，分子標記特指基因組特定區(qū)域的用以區(qū)分物種的DNA序列。DNA條形碼概念提出之初，希望能用一個短的分子標記來區(qū)分來自不同類群的生物，特別是區(qū)別不同物種[29]，但實踐證明，這樣的條形碼并不容易找到。如今在動物中一般使用COI基因，在植物中通常使用rbcL和matK（以及ITS）作為通用的分子標記[34-35]，BOLD選擇的分子標記就是這樣。但對于不同具體類群，如杜鵑花科，或杜鵑花屬植物，由于不同類群的特異性，適于其他植物的通用分子標記并不一定好用，這體現在分子標記引物的擴增效果和分子標記的分辨率等方面。

2.2 分子標記對于DNA條形碼研究的影響

分子標記需要有一定的變異性，從而可以區(qū)別不同的物種;還需要有相對的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性一方面體現在物種內部的遺傳距離要小于物種之間的遺傳距離，一方面體現在其片段兩端需要有保守的區(qū)域以便于設計引物。此外，引物擴增的效率、測序的成功率，都是決定一個分子標記是否可用于DNA條形碼鑒定的關鍵因素。當然，對于當前的應用而言，某一分子標記的參考序列庫是否完善也將直接影響到這一條碼在當下的可用性。

3 栽培品種野生親本溯源

栽培品種由于來源復雜，變異性強，老品種親本來源背景可能并不清晰，而新品種可通過雜交、選育的方式快速形成，加之栽培上對使用的品種來源、栽培歷史往往未能準確記錄（甚至許多品種的名稱都未能規(guī)范、統(tǒng)一，國內有不少栽培杜鵑花培育的單位，但很少有在品種登陸權威申請登記品種名稱的），故品種間遺傳背景關系較難明確。而品種間自然分類關系不明確將影響對品種的進一步選育、繁殖等開發(fā)、研究。DNA條形碼技術可以有效地運用于當下數以萬計的杜鵑花品種遺傳背景的分析，或者更準確地說，對其野生親本溯源。通過遺傳信息推測其母父本可能是哪一個野生物種，或者可能是哪幾個野生物種之一，這將是分子生物學運用于杜鵑花品種分類研究的利器。本文以分辨率較高的matK與psbA-trnH序列為例，建立UPGMA樹，試圖對栽培品種野生親本進行初步溯源，并將其結果進行展示（圖1）。結果顯示，利用matK與psbA-trnH二基因序列聯(lián)合建立UPGMA樹時，部分杜鵑花屬栽培品種可與野生種聚為一支，這說明可以利用DNA條形碼技術對栽培品種展開初步的野生親本溯源工作。

當然，具體到DNA條形碼鑒定品種問題，尤其是新品種的分子鑒定，從技術上看，最為重要的還是參考序列庫的完善，所以這一問題的解決同樣需要進一步加強參考序列庫的建設工作。出于對上述問題的考慮，或許可以在合適時候建議新品種的審定（甚至是品種登陸權威的登記）必須提交DNA條形碼序列作為特征參考指標，類似的規(guī)范和實踐已經在菌物分類學研究[36-37]和中藥DNA條形碼研究[38-39]中得到了應用并日益完善。

4 展 望

本文通過對杜鵑花屬植物DNA條形碼鑒定相關的原理、技術和應用的簡要介紹，以及對存在問題和需要克服困難的分析，建議杜鵑花研究者將野生種的系統(tǒng)分類研究與整合二代測序技術進行合理結合，建設完善的條形碼參考序列庫，并結合基因組學研究更深入地篩選分子標記，優(yōu)化實驗條件，以更好地將DNA條形碼研究和鑒定技術運用于杜鵑花品種鑒定和相關研究中。

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