陳 岳（中國(guó)文化遺產(chǎn)研究院 北京 100029）

杜 靖（中國(guó)文化遺產(chǎn)研究院 北京 100029）

潘 皎（南開大學(xué) 天津 300071）

一、“南海Ⅰ號(hào)”船體發(fā)掘與保護(hù)

“南海Ⅰ號(hào)”沉船是迄今為止我國(guó)發(fā)現(xiàn)的保存最為完整的古代大型遠(yuǎn)洋船舶。2007年，“南海Ⅰ號(hào)”沉船被成功整體打撈出水。后連同打撈沉箱移入陽江市海陵島廣東海上絲綢之路博物館內(nèi)，浸沒保存于“水晶宮”中。2013年，“南海Ⅰ號(hào)”考古發(fā)掘和文物保護(hù)工作正式啟動(dòng)，在博物館室內(nèi)采用飽水發(fā)掘法，逐層降低“水晶宮”的水位，自上而下順序發(fā)掘沉箱內(nèi)的遺存。發(fā)掘階段的文物保護(hù)工作主要配合考古作業(yè)，開展出水文物的現(xiàn)場(chǎng)穩(wěn)定性保護(hù)。

隨著發(fā)掘工作的逐步推進(jìn)，埋藏在海底淤泥和凝結(jié)物中的“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體慢慢暴露出來。到本文撰寫時(shí)，船體內(nèi)側(cè)已基本展現(xiàn)出來，外側(cè)淤泥也按計(jì)劃開始清除（圖1）。在“水晶宮”水位降低后，高出水位的遺址部分由于失水容易發(fā)生硬化、干裂、收縮，從而對(duì)船體造成破壞；而已經(jīng)從淤泥中發(fā)掘出的船體部分，暴露在空氣中也極易失水干燥，進(jìn)而會(huì)發(fā)生收縮、變形，甚至產(chǎn)生斷裂和塌陷。為妥善保存“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體，防止這類病害損傷的發(fā)生，文物保護(hù)工作者在發(fā)掘過程中通過多種方式，對(duì)遺址和暴露出的船體木質(zhì)構(gòu)件開展了長(zhǎng)期持續(xù)的保濕工作。由最初采用人工噴淋作業(yè)的方式，到逐步建立起固定式噴淋系統(tǒng)，再根據(jù)考古發(fā)掘工作的需要搭建了天車移動(dòng)噴淋系統(tǒng)，并對(duì)天車移動(dòng)噴淋系統(tǒng)進(jìn)行了多次升級(jí)改造，有效保障了船體保濕工作的進(jìn)行（圖2）。

二、船體微生物病害

廣東海上絲綢之路博物館所處陽江市海陵島氣候溫暖，夏季氣溫高。館內(nèi)考古發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境空氣濕度常年維持在70%RH以上，最高可達(dá)97.8%RH。在文物保護(hù)工作開展初期，曾采取用宣紙、無紡布對(duì)船木進(jìn)行覆蓋和用塑料膜對(duì)船木進(jìn)行包裹的方式進(jìn)行保濕。這樣的環(huán)境條件和保護(hù)措施有利于木質(zhì)船體的保護(hù)，同時(shí)也有利于微生物的生長(zhǎng)。為了防止木質(zhì)船體發(fā)生霉變、降解等微生物病害，在對(duì)“南海Ⅰ號(hào)”進(jìn)行保濕噴淋工作的初期，保護(hù)工作者在噴淋液中加入了硼酸、硼砂作為防霉劑。

在后續(xù)“南海Ⅰ號(hào)”沉船現(xiàn)場(chǎng)保護(hù)工作實(shí)施過程中，在木質(zhì)船體表面發(fā)現(xiàn)了一些白色粉末狀、絮狀物質(zhì)（圖3）。這些白色物質(zhì)呈區(qū)片狀，廣泛分布于船體各區(qū)域，且隨時(shí)間推移其分布區(qū)域和面積有增加的趨勢(shì)。

對(duì)這些白色物質(zhì)進(jìn)行提取，并在4℃條件下保存至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行顯微鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)少量樣品在顯微鏡下呈顆粒狀，無明顯菌絲狀的微生物，應(yīng)該是由船木中析出的海鹽類物質(zhì)；而大部分樣品在顯微鏡下有明顯的呈菌絲狀微生物細(xì)胞，菌絲直徑為7-10μm，判斷為真菌（圖4）。由此可知，硼酸、硼砂對(duì)此種微生物沒有起到有效的抑制作用。為了明確微生物病害情況，開展有針對(duì)性的治理措施，對(duì)滋生于“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體表面的微生物進(jìn)行了取樣分析。

三、微生物檢測(cè)分析

為盡可能揭示“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體表面的微生物群落組成，微生物檢測(cè)分析采用了克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法。

（一）樣品采集

用手術(shù)刀刮取微生物樣品放在滅菌離心管，然后立即放置在加有冰塊的保溫桶內(nèi)保存至實(shí)驗(yàn)室。

（二）DNA提取

選用MO BIO公司的“土壤DNA提取試劑盒”（PowerSoil DNA Isolation Kit），對(duì)“南海Ⅰ號(hào)”船體樣品進(jìn)行前處理并提取樣品總DNA。

（三）克隆文庫(kù)

細(xì)菌選用擴(kuò)增細(xì)菌1 6 s r D N A的通用引物341f-907r，真菌選用擴(kuò)增真菌18s rDNA的通用引物ITS1-ITS4：

341f：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’

907r：5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反應(yīng)條件為，反應(yīng)體系：模板2μL，10×Taq酶buffer 2.5μL，dNTP（2.5mM）2μL，引物（10μM）各1μL，Taq酶（5U/μL），加滅菌ddH2O至25μL。條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變形30s，54℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，30個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將得到的PCR產(chǎn)物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化回收。

依照TaKaRa公司提供的pBackZero-T Vector Cloning Kit載體建立連接體系：PMD19-T vector 1μL（50ng/μL），solution I 5μL，PCR產(chǎn)物84ng，滅菌去離子水加至10μL，16℃金屬浴12h。感受態(tài)細(xì)胞為TaKaRa公司提供的Escherichia coli DH5α菌株，轉(zhuǎn)化，將細(xì)胞均勻涂布在含氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

隨機(jī)挑取克隆文庫(kù)中白色菌落，每份樣品挑取20～40個(gè)克隆，進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證其是否為正確的轉(zhuǎn)化子，同時(shí)點(diǎn)備板放到37℃進(jìn)行培養(yǎng)，把正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序。菌落PCR中，細(xì)菌使用引物341f-907r，真菌使用引物ITS1-ITS4。

（四）高通量測(cè)序

將點(diǎn)好的轉(zhuǎn)化子平板進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列與GenBank比較，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中同源序列判斷所得序列的種屬。統(tǒng)計(jì)每份樣品獲得的微生物序列的次數(shù)，判斷樣品所感染的主要微生物種類，采用以下標(biāo)準(zhǔn)（S：待測(cè)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列相似度）：

細(xì)菌16s rDNA：S≥97%，同種；85＜S＜97%，同屬。

真菌ITS：S≥99%，同種；95＜S＜99%，同屬。

四、檢測(cè)結(jié)果與討論

（一）克隆文庫(kù)結(jié)果

N H I-1號(hào)樣品的原核生物中，芽孢桿菌屬（Bacillus）占總克隆數(shù)比例為72%，是主要原核致病菌，其次是硫桿菌屬(Filobacillus)占總克隆數(shù)比例為25%，其余未知的克隆占比相對(duì)較低。NHI-1號(hào)樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占總克隆數(shù)比例97%，是主要真菌致病菌。

N H I-2號(hào)樣品的原核生物中，海源菌屬(Idiomarina）占總克隆數(shù)比例為67%，是主要原核致病菌，其余的克隆占比相對(duì)較低。NHI-2號(hào)樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比例為97%，是主要真菌致病菌。

（二）高通量測(cè)序結(jié)果

N H I-1號(hào)樣品的原核生物中，鹽單胞菌屬（Halomonas）占細(xì)菌總數(shù)的14%，未知菌占細(xì)菌總數(shù)的72%，其余種屬占比相對(duì)較低。NHI-1號(hào)樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比為97%，為主要真菌致病菌。

N H I-2號(hào)樣品的原核生物中，海源菌屬(Idiomarina）占細(xì)菌總數(shù)的26%，是主要原核致病菌，其次是鹽單胞菌屬（Halomonas）占細(xì)菌總數(shù)的12%，未知菌占比為40%。NHI-2號(hào)樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比為97%，是主要真菌致病菌。

（三）結(jié)果討論

無論是克隆文庫(kù)測(cè)序還是高通量測(cè)序的結(jié)果，NHI-1及NHI-2的主要病害真菌都是鐮刀菌屬（Fusarium），且在克隆文庫(kù)測(cè)序與高通量測(cè)序結(jié)果中所占的比例相同，都是97%。在細(xì)菌方面，NHI-2樣品在兩種方法的測(cè)試結(jié)果中都是海源菌屬(Idiomarina）所占比例最大；而NHI-1樣品在克隆文庫(kù)測(cè)序結(jié)果中較多的是芽孢菌屬（Bacillus），在高通量測(cè)序結(jié)果中除去未知菌外，最多的是鹽單胞菌屬（Halomonas）。

其中鐮刀菌在土壤和各種有機(jī)質(zhì)等環(huán)境中廣泛分布，可以降解木材中的纖維素、木質(zhì)素和木聚糖，為木材危害很大。鐮刀菌屬中腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可以產(chǎn)纖維素酶[1][2]。Lozovaya等人的研究表明腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）在感染大豆根部的過程可降解木質(zhì)素，而且孢子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶可促進(jìn)其侵染效率[3][4]。NORRIS從木材中分離到的腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可分解芳香酸和木質(zhì)素[5]。Saparrat等人的研究表明腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可以產(chǎn)低活性胞外MnP和MIP兩種與木質(zhì)素降解有關(guān)的酶[6]。此外，降解木質(zhì)素過程中的關(guān)鍵酶漆酶在腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）中也有發(fā)現(xiàn)[7][8]。鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）除了能產(chǎn)生纖維素酶之外，還能產(chǎn)生木聚糖酶[9][10]。

五、微生物治理效果

通過對(duì)“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體上的微生物開展檢測(cè)分析，可以了解到其中最主要的病害微生物是鐮刀菌，其對(duì)船體木材的安全保存威脅最大，應(yīng)作為主要治理對(duì)象。

通過對(duì)相關(guān)微生物抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)采用復(fù)配的異噻唑啉酮對(duì)鐮刀菌的抑制效果最好（圖5），且其具有廣譜性、高效性及環(huán)境友好性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人體無害，適合用于考古發(fā)掘現(xiàn)場(chǎng)。

之后，在“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體保護(hù)工作中，向船體噴淋保濕液中添加了復(fù)配的異噻唑啉酮溶液，以此對(duì)船體的微生物病害開展治理。分別在開展治理后6個(gè)月和12個(gè)月進(jìn)行觀察，明顯可見白色菌斑逐步消退（圖6）。進(jìn)一步分析結(jié)果也顯示鐮刀菌屬在木質(zhì)船體表面微生物群落中占比明顯降低。

結(jié)語

“南海Ⅰ號(hào)”獨(dú)特的發(fā)掘方式和保存環(huán)境是造成其產(chǎn)生鐮刀菌病害的主要原因。海洋出水沉船往往采用水下考古作業(yè)的方式進(jìn)行發(fā)掘，在被打撈出水后也多采用浸沒保存的方式。在這個(gè)過程中，沉船木材絕大部分時(shí)間與空氣隔絕，從而不利于鐮刀菌的生長(zhǎng)。“南海Ⅰ號(hào)”沉船的考古發(fā)掘環(huán)境溫暖高濕，有利于鐮刀菌的生長(zhǎng)，船體木材中的纖維素、木質(zhì)素、木聚糖等成分又為鐮刀菌提供了養(yǎng)料。這些因素共同造成了微生物病害的產(chǎn)生。通過鑒別致病微生物種類，篩選具有針對(duì)性的抑菌劑，“南海Ⅰ號(hào)”船體的微生物病害得到了有效治理。下一步，應(yīng)合理控制抑菌劑用量防止病菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)開展備用抑菌劑的篩選工作，以保障“南海Ⅰ號(hào)”木質(zhì)船體的長(zhǎng)期安全保存。