魏 萍 陳志斌 王春娥 李大治 陳可強(qiáng)

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州350102)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是典型的阻塞性肺疾病，COPD會常伴有呼吸問題和氣流阻塞，主要表現(xiàn)為呼吸短促、咳痰現(xiàn)象[1,2]。吸煙、空氣污染和揚(yáng)塵是造成COPD的主要原因[3]。作為一種重要的公眾健康問題，COPD已經(jīng)成為中國第三大死亡原因[4]。流行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2015年中國COPD患病率為8.6%，約有999萬患者患有COPD[5,6]。雖然西藥在COPD的治療中取得了一定治療效果，但是具有為患者帶來極大痛苦的副作用。而中藥在COPD的治療過程中具有療效好，副作用小等特點，越來越受到重視。槲皮素(Quercetin，QT)是一種天然飲食類黃酮，富含于水果、蔬菜、綠茶和一些合成藥物之中，具有較低毒性[7]。近年來，QT廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌引起大量研究者關(guān)注[8]。在COPD發(fā)病過程中，IL-6和TNF-α等可通過破壞小氣道和肺泡組織結(jié)構(gòu)與功能導(dǎo)致患者肺功能下降[9,10]。然而QT是否對慢性肺阻塞性肺病有保護(hù)作用及分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。目前主要治療手段為控?zé)?、氧療、支氣管擴(kuò)張劑和呼吸興奮劑等，雖然臨床療效也有所提高，但是目前高發(fā)病率和高死亡率的現(xiàn)狀并無明顯改善[11,12]。積極探索COPD病理機(jī)制，對發(fā)現(xiàn)有效治療靶點有十分重要的意義。本研究根據(jù)前人科研成果，探究QT對大鼠COPD模型的治療效果和作用機(jī)制，期望為COPD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Click-iT?Plus TUNEL assay試劑盒(貨號：C10618)購自Invitrogen公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：C0105)購自碧云天。Masson Stain Kit Masson染色試劑盒(貨號：60532ES58)購自上海翊圣生物科技有限公司。Caspase-3(貨號：ab13847)、Caspase-9(貨號：ab202068)、TGF-β1(貨號：ab64715)、α-SMA(貨號：ab5694)、GAPDH(貨號：1056)一抗購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。IL-6(貨號：E-EL-R0015c)、TNF-α(E-EL-R0019)、IL-10(E-EL-R0016)和ELISA試劑盒購自Elabscience。AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)購自北京貝蘭博科技有限公司。

1.1.2儀器 PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國伯樂公司。Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司。Multiskan GO酶標(biāo)儀購自Thermo。

1.2方法

1.2.1應(yīng)用熏香煙聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖(LPS)的方法造成大鼠COPD模型 經(jīng)學(xué)校實驗動物倫理委員會審查同意后，選擇40只3周齡SPF級別SD大鼠,購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001。隨機(jī)分為四組，分別設(shè)置健康對照組(Healthy Ctrl組)、COPD模型組(COPD組)、QT單獨(dú)作用組(QT組)和COPD+QT組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后給予香煙聯(lián)合氣道內(nèi)滴注LPS方法進(jìn)行造模：將各模型組大鼠置于自制有機(jī)玻璃熏煙箱中，蓋上蓋子；將黃果樹牌香煙插入點煙盒，然后打開微型真空泵，泵入煙霧。每次點煙20支，熏煙1 h，連續(xù)進(jìn)行3個月。大鼠經(jīng)氣道內(nèi)滴注LPS(1 mg/kg)。空白大鼠只進(jìn)行生理鹽水滴注，不做煙熏處理，建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型后進(jìn)行相關(guān)實驗。用藥治療：口服給藥QT連續(xù)四周(50 mg/kg)后，進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.2.2大鼠基本指標(biāo)檢測 QT治療結(jié)束后樣本提取前，稱量大鼠體重。檢測大鼠肺功能：大鼠禁食12 h后，用2%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，將大鼠仰臥固定，剪開頸部皮膚及肌肉進(jìn)行氣管插管，用AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)檢測大鼠肺功能。通過一秒用力呼吸氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)比率對大鼠肺功能進(jìn)行評價。

1.2.3HE染色 取左肺用生理鹽水充分沖洗，再用10%中性福爾馬林固定，切片經(jīng)3次二甲苯脫蠟，每次時間分別為15 min、15 min、10 min；梯度酒精脫苯，分別用100%、90%、80%、70%的酒精脫苯10 min；蒸餾水沖洗5 min，2次；蘇木素染核15 min，蒸餾水沖洗；0.5%的鹽酸酒精分色，用蒸餾水沖洗15 min；70%和80%酒精先后浸泡10 min，復(fù)染伊紅1 min，90%酒精分化10 s；95%酒精脫水2次，各10 min，100%酒精脫水2次，各15 min，二甲苯透明3次，每次時間分別為10 min、15 min、15 min；中性樹脂封片觀察。

1.2.4ELISA檢測炎癥因子 大鼠心臟取血1 ml，低溫離心機(jī)4 000 r/min 8 min，取上清液供實驗使用。加樣：分別設(shè)空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。溫育：用封板膜封板后置于37℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。溫育：再次用封板膜封板后置37℃溫育30 min。洗滌：再次小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。終止：每孔加入50 μl終止液，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色)。測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔吸光值(OD值)。測定在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.2.5TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 大鼠處死后組織經(jīng)過石蠟包埋，二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮二甲苯，再脫蠟5～10 min。無水乙醇5 min。90%乙醇2 min。70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。滴加20 μg/ml 不含DNase的蛋白酶K用P0106免疫染色洗滌液(20～37)℃作用15～30 min。PBS洗滌3次。配制適當(dāng)量TUNEL檢測液滴加樣品上，37℃避光孵育60 min。洗滌后用抗熒光猝滅封片液封片后顯微鏡下(激發(fā)波長范圍為450～500 nm)觀察。

1.2.6Masson染色 切片染色前先用蒸餾水潤濕玻片30～60 s。加入適量蘇木素核染液染色60 s，棄去，清洗液沖洗30 s。加入適量酸性品紅漿染液染色30～60 s，棄去，清洗液沖洗30 s。加入適量磷鉬酸分色液分色6～8 min，棄去。加入適量苯胺藍(lán)復(fù)染液染色5 min，棄去，用無水乙醇沖洗干凈。吹干后封片鏡檢。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集四組肺組織并取相同部位，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4℃封閉過夜，第2天加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。顯色并統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1QT改善COPD大鼠體重和肺功能指標(biāo) QT對大鼠COPD模型治療后，與Healthy Ctrl組相比，QT組大鼠體重和肺功能間無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組體重和肺功能均顯著下調(diào)；與 COPD組比較，COPD+QT組大鼠體重和肺功能均明顯改善(圖1)。

2.2QT抑制COPD肺臟病理損傷 HE染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組相比，QT組大鼠支氣管管腔、上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，管壁未見變厚，黏膜下層未見炎癥性細(xì)胞浸潤。提示QT使用對大鼠體征沒有明顯影響；與Healthy Ctrl組比較，COPD組大鼠支氣管管腔嚴(yán)重變形，上皮細(xì)胞明顯脫落，肺泡腔擴(kuò)大融合成肺大泡，管壁破壞、增厚，管壁周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤；與COPD組比較，COPD+QT組大鼠支氣管管腔形變恢復(fù)，上皮細(xì)胞脫落改善，管壁厚度逐漸恢復(fù)變薄，炎癥浸潤細(xì)胞明顯減少，肺泡腔擴(kuò)大融合現(xiàn)象明顯改善(圖2)。

2.3QT抑制肺泡細(xì)胞凋亡及相關(guān)因子表達(dá) TUNEL染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中細(xì)胞凋亡數(shù)目沒有明顯差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組細(xì)胞凋亡水平明顯下調(diào)(圖3A)。Western blot實驗結(jié)果顯示，與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中促凋亡因子Caspase-3和Caspase-9水平差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義；與Healthy Ctrl組比較，COPD組Caspase-3和Caspase-9水平均顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組Caspase-3和Caspase-9水平則顯著下降(圖3B)。

2.4QT降低血清中炎癥因子表達(dá) ELISA檢測血清中相關(guān)炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10結(jié)果顯示：與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著上升，而抑炎因子IL-10顯著下調(diào)；與COPD組比較，COPD+QT組炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著下調(diào)，抑炎因子IL-10明顯上調(diào)(圖4)。

2.5QT降低肺泡組織肺纖維化及凋亡通路分子活性 Masoon染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組相比，QT組極少藍(lán)色著色于肺泡細(xì)胞，大量胞漿被染成紅色；與Healthy Ctrl組比較：COPD組大量具有較深藍(lán)色著色于細(xì)胞中，很少胞漿紅色減少；與COPD組比較：COPD+QT組肺泡細(xì)胞著藍(lán)色降低，胞漿著紅色逐漸加深(圖5A)。Western blot檢測肺泡組織中TGF-β1和α-SMA結(jié)果顯示：與Healthy Ctrl組比較，QT組TGF-β1和α-SMA表達(dá)水平無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組TGF-β1和α-SMA表達(dá)水平顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組TGF-β1和α-SMA表達(dá)水平受到顯著下調(diào)(圖5B)。

圖1 不同處理組大鼠基本指標(biāo)測量Fig.1 Basic indexes of rats in different treatment groups were measuredNote: Healthy ctrl.Healthy rats;QT group.Rats received QT;COPD group.Rats treated by the LPS and cigarettes;COPD+QT.Rats treated by the LPS,cigarettes and QT.QT were treated for 4 weeks.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

圖2 HE染色鑒定肺泡細(xì)胞形態(tài)(×200)Fig.2 HE staining detected alveolus pulmonis cells morphology(×200)Note: QT were treated for 4 weeks.

圖3 肺泡組織中凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平Fig.3 Expression of apoptosis-related markers were detected in alveolus pulmonis Note: A.TUNEL；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

圖4 ELISA檢測顯示血清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in serum by Note: **.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

3 討論

COPD是一種進(jìn)展性疾病，最終會演變?yōu)槊刻彀l(fā)作，如行走或增加壓力都會導(dǎo)致呼吸困難[13]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。COPD患者肺內(nèi)含有多種炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等，炎性細(xì)胞被刺激因子激活后能夠產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，進(jìn)而損害氣道壁和肺部組織[14,15]。COPD屬于嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，目前已被行業(yè)列入重大疾病慢病管理體系內(nèi)。有關(guān)病理演變機(jī)制的研究已經(jīng)證明：慢性氣道炎癥是關(guān)鍵，病情進(jìn)展與肺對有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[9,10]。

QT幾乎存在于所有植物中，作為人類正常飲食的一部分，已具有悠久歷史。隨著對QT生物和藥理活性研究逐漸深入，越來越多的研究證明QT對人體頗有裨益，包括抗癌、抗過敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化和保心功能[16,17]。本研究也證實，對大鼠連續(xù)四周給藥(50 mg/kg)后，對大鼠體重、肺功能、肺泡結(jié)構(gòu)和凋亡等進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較并未有明顯差異。說明重要制劑QT對生物體具有較小影響，對大鼠沒有明顯毒性作用。此外一些前瞻性研究表明QT可有效抑制冠狀動脈、肺動脈血管收縮和降低血壓的功效[18]。更有研究表明QT可以顯著逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的形成[19]。本研究結(jié)果顯示，QT可以顯著改善COPD大鼠肺損傷情況，降低肺泡細(xì)胞凋亡和炎癥因子水平，抑制凋亡發(fā)生和炎癥水平。

圖5 肺纖維化及各處理相關(guān)凋亡基因表達(dá)水平Fig.5 Fibrosis and apoptosis related makers were detected in alveolus pulmonis Note: A.Masson；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

TGF-β1可以抑制多種細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，同時又可以誘導(dǎo)間質(zhì)樣細(xì)胞增殖和向肌成纖維細(xì)胞分化，來促進(jìn)傷口愈合和組織纖維化形成[20]。有研究表明，TGF-β1被認(rèn)為是體內(nèi)促纖維化生長因子最重要的分子。如IPF和博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化損傷中顯示TGF-β1表達(dá)增加[21]。TGF-β1體外可以激活成纖維細(xì)胞，體內(nèi)過表達(dá)可以造成肺持續(xù)的纖維化進(jìn)程[22]。TGF-β1調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的主要方式是通過控制α-SMA來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(膠原蛋白和黏聯(lián)蛋白)分泌；也有許多纖維化信號激活肌成纖維細(xì)胞功能的信號也由TGF-β1調(diào)節(jié)或激活[23]。TGF-β1一方面降低TNF-α活性來降低炎癥因子IL-6來抑制免疫炎癥[24-26]，IL-6是由多種細(xì)胞產(chǎn)生、具有誘導(dǎo)B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體的多功能細(xì)胞因子，可以通過凝聚膠原蛋白，抑制細(xì)胞外基質(zhì)分解，刺激成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致COPD氣道纖維結(jié)締組織形成及平滑肌增生，從而參與COPD氣道重構(gòu)[9,10]。而IL-10作為多效抗炎性細(xì)胞因子，具有重要的抗炎及免疫抑制作用[27]。本研究證明，COPD大鼠模型中TGF-β1和α-SMA的表達(dá)量急劇上升；但在經(jīng)過QT治療后，TGF-β1和α-SMA的表達(dá)量明顯下調(diào)，接近正常組大鼠體內(nèi)的表達(dá)水平，同時大鼠肺纖維化的程度也明顯緩解。

常見的凋亡途徑分為：內(nèi)源性凋亡(線粒體途徑)和外源性途徑。內(nèi)源性途徑常與細(xì)胞壓力應(yīng)激相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞感受到壓力之后便會激活BH3，使抗凋亡因子Bcl-2降低，從而減少對凋亡促進(jìn)因子Bax抑制，最終通過Caspase-9誘導(dǎo)Caspase3/6/7激活造成細(xì)胞發(fā)生凋亡；而外源性途徑則是依賴FASL，TNF-α及TRAIL與細(xì)胞上死亡受體結(jié)合后，進(jìn)一步激活Caspase 8來誘導(dǎo)Caspase3/6/7激活造成細(xì)胞凋亡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)COPD疾病模型組大鼠經(jīng)過QT治療后，Caspase-3和Caspase-9都受到明顯下調(diào)。TGF-β信號分子在多種重要信號途徑中參與多細(xì)胞應(yīng)答，如細(xì)胞增殖、分裂、凋亡、免疫及炎癥應(yīng)答等[29-31]。TGF-β1可以結(jié)合TNF-α共同抑制Caspase-3依賴的凋亡通路來抑制凋亡發(fā)生。綜合研究結(jié)果可以證明，當(dāng)COPD模型大鼠經(jīng)過QT治療后可以顯著地降低TNF-α和TGF-β1的表達(dá)水平，有效降低下游Caspase-3和Caspase-9的活性，從而降低肺泡細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，QT對COPD有一定保護(hù)作用，通過降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性來抑制細(xì)胞凋亡及降低細(xì)胞炎癥因子釋放。本研究通過COPD損傷大鼠模型初步探究QT在臨床治療COPD損傷方面具有相關(guān)性和可行性。但是QT在體內(nèi)發(fā)揮功能的信號通路比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步明確其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制并選擇關(guān)鍵靶點分子才能為精準(zhǔn)治療慢性阻塞性肺疾病提供指導(dǎo)。