鞠婧捷，蘇青峰，李有棟，李進(jìn)偉，曹培讓，劉元法

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122； 2.重慶紅蜻蜓油脂有限責(zé)任公司，重慶 400010)

油脂深度煎炸是最常見(jiàn)的食品烹飪方法之一。食用油在煎炸過(guò)程中發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致煎炸油的理化指標(biāo)發(fā)生變化，產(chǎn)生氧化甘油三酯、聚合甘油三酯和游離脂肪酸等極性大于甘油三酯的組分，這些極性組分是熱氧化油脂劣變最主要的成分[1]。同時(shí)，極性組分含量也是衡量油脂質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[2]?，F(xiàn)有關(guān)煎炸油的文獻(xiàn)大多圍繞在穩(wěn)定性好的飽和油脂體系，如棕櫚油[3-4]，而對(duì)不飽和油脂體系——花生油的相關(guān)研究較少。越來(lái)越多的人將花生油作為主要的食用油脂，尤其是我國(guó)的北方地區(qū)，食品攤位甚至某些成熟的食品店、飯店為了降低費(fèi)用會(huì)使用反復(fù)煎炸的花生油，煎炸花生油的使用現(xiàn)狀遠(yuǎn)比我們想象的要嚴(yán)峻。因此，研究煎炸花生油對(duì)健康的影響具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，煎炸油和極性組分的研究主要集中在開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如Li等[5]發(fā)現(xiàn)極性組分對(duì)昆明種小鼠的脂質(zhì)代謝有不利的影響，穆昭[6]研究表明極性組分會(huì)造成小鼠的骨髓多染紅細(xì)胞的微核率增加，同時(shí)引起脂質(zhì)代謝紊亂。然而，目前有關(guān)極性組分對(duì)細(xì)胞影響的研究，尤其是脂質(zhì)代謝方面的研究相對(duì)較少。脂質(zhì)代謝是研究非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的重要前提條件，正如“雙重打擊”假說(shuō)所解釋的，NAFLD發(fā)生的病理機(jī)制第一重“打擊”主要?dú)w因于脂質(zhì)代謝紊亂[7]。脂質(zhì)代謝紊亂是指脂質(zhì)合成和輸出的不平衡，可能會(huì)促使甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)積累[8-9]。脂質(zhì)代謝基因發(fā)生異常是導(dǎo)致肝細(xì)胞病變的關(guān)鍵控制點(diǎn)。固醇元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪生成，是一種控制膽固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子[10]。SREBP-1c通過(guò)激活脂質(zhì)合成所需的基因脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)優(yōu)先調(diào)節(jié)從頭脂肪生成，而SREBP-1c通過(guò)激活膽固醇合成所需的基因3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)來(lái)控制膽固醇體內(nèi)平衡[11]。HepG2細(xì)胞來(lái)源于肝細(xì)胞癌癥患者的肝臟，保留了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多形態(tài)特征，其特定酶的表達(dá)和活性與肝細(xì)胞相同，同時(shí)HepG2細(xì)胞比其他細(xì)胞系更敏感[8, 12]。因此，本研究使用煎炸花生油中提取的極性組分，通過(guò)HepG2細(xì)胞構(gòu)建脂質(zhì)代謝的細(xì)胞模型，研究極性組分對(duì)HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)代謝的相關(guān)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生油(不含抗氧化劑)，無(wú)錫德合食品科技有限公司；雞腿，無(wú)錫歐尚超市。乙醚、石油醚(沸程30～60℃)、正己烷、甲醇，異丙醇均為分析純；硅膠(200～300目)，青島海洋化工有限公司；HepG2細(xì)胞，中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞研究所；油紅O，美國(guó)索萊寶生物科技有限公司；胰酶消化液，美國(guó)Gibco公司;MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SG Fast Qpcr Master Mix試劑盒，上海生工股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

EF-818L單缸單篩電炸鍋，江蘇秉宏生物科技有限公司；Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煎炸花生油的制備

將7 L花生油置于電炸鍋中并保持溫度在(180±2)℃，油炸過(guò)程中未補(bǔ)充新鮮油。煎炸實(shí)驗(yàn)每天開(kāi)展10 h，連續(xù)4 d，每隔1 h換500 g雞腿進(jìn)行煎炸,第4天結(jié)束時(shí)收集煎炸花生油樣品，在-20℃避光保存。

1.2.2 極性組分的制備

根據(jù)GB 5009.202—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食用油中極性組分(PC)的測(cè)定》第二法柱層析法制備極性組分，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。先用50 g硅膠裝柱，再用洗脫劑A(石油醚-乙醚，體積比87∶13)洗滌硅膠柱。將溶于洗脫劑A的5 g花生油樣品倒入柱中同時(shí)用洗脫劑A洗脫花生油樣品直至非極性組分洗脫完畢，再用750 mL洗脫劑B(乙醚)和250 mL洗脫劑C(甲醇)收集極性化合物，洗脫速度15 mL/min。最后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40℃)和真空干燥(40℃，0.01 MPa)收集溶解在洗脫劑B和洗脫劑C中的極性化合物。為了更有效地分離極性化合物，使用薄層色譜進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

1.2.3 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞均勻分散在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待HepG2細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，吸除原培養(yǎng)液，用1 mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)清洗2遍，加入1 mL胰酶消化液，放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃消化1 min，加2 mL完全培養(yǎng)液終止消化，輕緩地用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，再全部轉(zhuǎn)移至另一個(gè)15 mL離心管中，800 r/min離心5 min，吸除培養(yǎng)液，再加入3 mL完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后取相應(yīng)數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 HepG2細(xì)胞的處理

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)20×104個(gè)HepG2細(xì)胞2 mL 并將其接種于六孔板中，培養(yǎng)1 d后細(xì)胞完全貼壁，加入質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL的極性組分2 mL，對(duì)照組不加入極性組分，用無(wú)血清的培養(yǎng)基代替，孵育24 h后，用PBS清洗獲得極性組分處理和對(duì)照組的HepG2細(xì)胞。

1.2.5 油紅染色

通過(guò)油紅染色評(píng)估HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的情況。將1.2.4獲得的HepG2細(xì)胞，用10%甲醛固定30 min，然后油紅O染料進(jìn)行染色，PBS洗掉染料后，采用倒置熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)

將1.2.4獲得的HepG2細(xì)胞，使用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒提取RNA、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和2×SG Fast Qpcr Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物通過(guò)Primerbank設(shè)計(jì)，經(jīng)上海生工科技股份有限公司合成。引物信息如表1所示。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，將每個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行平均計(jì)算，用2-ΔΔCt方法[13]計(jì)算不同基因相對(duì)于對(duì)照基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)變化。

表1 RT-PCR的引物序列

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS7．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan’s檢驗(yàn)和Anova分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 極性組分對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

圖1是用不同質(zhì)量濃度的極性組分處理HepG2細(xì)胞并油紅染色的40×顯微鏡的放大圖。

注：A.0 mg/mL; B.0.1 mg/mL; C.0.5 mg/mL; D.1.0 mg/mL; E.2.0 mg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度的極性組分對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)不加入極性組分時(shí)(圖1A)，細(xì)胞界限較為明顯，細(xì)胞漿充足，含有少許紅色圓形結(jié)構(gòu)可能是細(xì)胞自身存在的脂質(zhì)，幾乎沒(méi)有油紅O的附著，說(shuō)明不加入極性組分的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)很少。隨著極性組分含量逐漸增加，脂質(zhì)沉積情況逐漸加重。當(dāng)極性組分的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)(圖1B)，脂質(zhì)沉積與對(duì)照組存在顯著不同，但是與極性組分質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)(圖1C)差異不大，紅色小泡狀的脂滴主要附著在細(xì)胞的邊緣，細(xì)胞并沒(méi)有大部分被聚積的脂質(zhì)占滿，細(xì)胞膜的界限開(kāi)始不明顯，體現(xiàn)了小泡狀脂肪生成特征。然而，當(dāng)極性組分的質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/mL時(shí)，被油紅O附著的區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，以不均勻的形態(tài)分布在胞漿中。當(dāng)HepG2細(xì)胞用2.0 mg/mL的極性組分處理時(shí)，不僅是脂質(zhì)聚積的現(xiàn)象變得更加明顯，而且分不清細(xì)胞膜的位置，細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了很大的改變，說(shuō)明當(dāng)極性組分的質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度時(shí)，不僅僅會(huì)造成脂質(zhì)積累還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變，并且造成一定程度的細(xì)胞變性。目前鮮有文章報(bào)道花生油的極性組分對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況的影響。因此，我們以梯度劑量處理HepG2細(xì)胞的方式，觀察極性組分對(duì)脂質(zhì)沉積的作用，與極性組分應(yīng)用到老鼠中的研究結(jié)果一致[5]，極性組分不僅會(huì)引起老鼠肝臟脂質(zhì)堆積，也會(huì)造成HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積，這是引發(fā)肝臟等相關(guān)疾病的第一重關(guān)鍵因素，為證明極性組分引起NAFLD等疾病提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

2.2 HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝基因表達(dá)

研究表明,FAS、ACC和HMGCR是SREBP-1c的下游靶基因[14]。其中，F(xiàn)AS催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成軟脂酸，ACC催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，都是控制脂質(zhì)合成的關(guān)鍵限速酶。這4種脂質(zhì)合成基因?qū)τ谡{(diào)控細(xì)胞的脂質(zhì)代謝有很大的影響，為了檢測(cè)極性組分對(duì)HepG2細(xì)胞調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，測(cè)定了這4種基因的mRNA水平,結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，SREBP-1c和FAS的mRNA的表達(dá)均隨極性組分質(zhì)量濃度的增加出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)(圖2A和圖2B)。盡管ACC的mRNA的表達(dá)在極性組分質(zhì)量濃度低于1.0 mg/mL時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，但是當(dāng)極性組分質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí)，同樣出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)(圖2C)。一定程度上證明了SREBP-1c對(duì)其下游基因FAS和ACC起到了上調(diào)作用。由圖2D可知，不同質(zhì)量濃度的極性組分對(duì)HMGCR的mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有影響，證明了盡管HMGCR基因同樣是SREBP-1c的下游靶基因，但是其對(duì)HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝沒(méi)有起到調(diào)控作用。由此可以認(rèn)為極性組分在HepG2細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)SREBP-1c、FAS、ACC途徑引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂。

3 結(jié) 論

研究界普遍認(rèn)為極性組分對(duì)健康存在潛在危害，但是造成危害的細(xì)胞學(xué)的現(xiàn)象和原因卻不清楚。本文研究表明：在病理現(xiàn)象方面，極性組分導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累；在分子水平上，極性組分上調(diào)HepG2細(xì)胞的SREBP-1c、FAS、ACC脂質(zhì)合成基因途徑，引起脂質(zhì)合成速率和游離脂肪酸水平的增加，從而導(dǎo)致了脂肪酸合成和分解的不平衡。本研究是首次解釋不飽和體系的植物油——花生油產(chǎn)生的極性組分可以導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，可以用作預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)疾病(如NAFLD)的新靶點(diǎn)，并且為研究煎炸油對(duì)肝臟疾病的影響提供了新的切入點(diǎn)。