馬曉英，馬 琨 ，周 艷，冶秀香，楊金娟，牛紅霞，馬 玲

(1.寧夏科技發(fā)展戰(zhàn)略和信息研究所，銀川 750001；2.寧夏大學(xué) 西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，銀川 750021；3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

化肥和有機(jī)肥是耕地土壤養(yǎng)分的主要來(lái)源，但長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)機(jī)肥而不輸入有機(jī)肥是導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)流失，土壤結(jié)構(gòu)惡化，生物活性降低，土壤肥力下降的主要原因[1]。有機(jī)肥、無(wú)機(jī)肥的配合施用不但有助于植物營(yíng)養(yǎng)供給，而且能通過(guò)土壤有機(jī)質(zhì)的補(bǔ)充保持土壤肥力[2]。因此，有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥的配合施用是發(fā)展可持續(xù)肥料管理策略的一種有效途徑。

土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)分解和碳、氮等養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用[3]。有研究認(rèn)為，采用有機(jī)、無(wú)機(jī)肥配施的方法，可以調(diào)控長(zhǎng)期連作棉田土壤微生物區(qū)系和組成結(jié)構(gòu)比例[4]；黃砂壤上有機(jī)、無(wú)機(jī)肥配施可以增加土壤細(xì)菌豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)，提高微生物功能多樣性[5]。Zhong和Cai[6]報(bào)道，礦質(zhì)肥料的施用增加了微生物的生物量和多樣性。有機(jī)和無(wú)機(jī)肥料的施用也會(huì)影響土壤微生物的多樣性、組成、豐富度和功能；其中，有機(jī)和無(wú)機(jī)肥料施用下，氮肥是驅(qū)動(dòng)相對(duì)豐度較高的土壤細(xì)菌分類群變化的重要因素，有機(jī)物料引起細(xì)菌分類群的變化則主要體現(xiàn)在豐度較低的細(xì)菌群落上[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)36a無(wú)機(jī)肥處理下，土壤細(xì)菌多樣性呈下降趨勢(shì)，而在有機(jī)肥處理下，細(xì)菌的多樣性呈上升趨勢(shì)。單獨(dú)施用有機(jī)肥或與無(wú)機(jī)肥料配合施用都會(huì)增加土壤細(xì)菌多樣性[9]，但稻田中水稻秸稈的翻壓施用卻沒(méi)影響細(xì)菌多樣性[10]。在土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分缺乏的狀況下，有機(jī)肥的施用增強(qiáng)了土壤細(xì)菌和真菌群落，對(duì)土壤放線菌沒(méi)有影響，而化學(xué)肥料的影響則與之相反[11]。因此，土壤細(xì)菌群落受不同施肥措施的影響可能會(huì)產(chǎn)生不同的響應(yīng)。

寧夏中部干旱區(qū)，水資源相對(duì)緊缺，區(qū)域土壤有機(jī)碳含量偏低[12]。利用傳統(tǒng)有機(jī)、無(wú)機(jī)結(jié)合的培肥方式，隨外源有機(jī)物的類型及輸入數(shù)量的高低變化，會(huì)對(duì)旱作區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生何種影響？ 因此，本研究選擇連續(xù)8a 有機(jī)、無(wú)機(jī)肥定位培肥試驗(yàn)農(nóng)田土壤，利用Illumina MiSeq平臺(tái)的高通量測(cè)序方法，假設(shè)連續(xù)中長(zhǎng)期有機(jī)、無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥方式在促進(jìn)土壤肥力提升的同時(shí)，會(huì)顯著影響土壤細(xì)菌多樣性、改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群會(huì)因外源有機(jī)碳輸入數(shù)量及類型而產(chǎn)生顯著差異。研究旨在揭示農(nóng)田培肥措施與土壤細(xì)菌群落間的相互關(guān)系，以期為旱作農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中施肥制度選擇以及土地生產(chǎn)力的提升，提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于寧夏吳忠市同心縣王團(tuán)鎮(zhèn)旱作節(jié)水示范園區(qū)(105°59′E，36°51′N(xiāo))，該區(qū)域年均降雨量200 mm，年均蒸發(fā)量2 325 mm。供試土壤為灰鈣土，試驗(yàn)前0～20 cm土壤基礎(chǔ)理化性狀為：全氮0.25 g·kg-1、全磷0.45 g·kg-1、有機(jī)碳2.77 g·kg-1、堿解氮11.06 mg· kg-1、速效磷10.86 mg·kg-1、速效鉀97.08 mg·kg-1、pH 8.74。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始于2011年4月，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為90 m2(15 m×6 m)，3次重復(fù)，2011-2018年，采用馬鈴薯(Solanumtuberosum)-馬鈴薯-油用向日葵(HelianthusannuusLinn.)-馬鈴薯-油用向日葵-玉米(ZeamaysLinn.)-玉米-玉米輪作方式，滴灌量150 m3。設(shè)6個(gè)處理，分別為不施肥(T0)、單施化肥[(化學(xué)氮、磷、鉀肥配施)，T1]、化肥與牛糞配合施用(T2)、化肥與羊糞配合施用(T3)、化肥與生物有機(jī)肥配合施用(T4)和化肥與黃腐酸鉀配合施用(T5)。

馬鈴薯、玉米的氮、磷、鉀(化學(xué))肥施用量分別為(N)391.35 kg·hm-2、(P2O5)195.6 kg·hm-2、(K2O)210 kg·hm-2；油用向日葵氮、磷、鉀(化學(xué))肥施用量分別為(N) 391.35 kg·hm-2、(P2O5) 195.6 kg·hm-2、(K2O )98 kg·hm-2。牛糞、羊糞基施量為37 500 kg·hm-2·a-1，折合有機(jī)碳用量分別為10 110 kg·hm-2·a-1、12 555 kg·hm-2·a-1；生物有機(jī)肥、黃腐酸鉀施用量為1 200 kg·hm-2·a-1，折合有機(jī)碳用量分別為210 kg·hm-2·a-1、350 kg·hm-2·a-1。70%的化學(xué)氮肥及全部磷、鉀肥和有機(jī)肥作基肥，剩余30%的氮肥作追肥，各施肥處理中化學(xué)肥料的氮、磷、鉀總量相同。2018年作物收獲時(shí)，采用多點(diǎn)取樣法采集0～20 cm土層土壤樣品，每小區(qū)采集2個(gè)土壤樣本，各小區(qū)土壤樣本獨(dú)立，共采集36個(gè)土壤樣本，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分土樣過(guò)1 mm篩，存放于 -80 ℃冰箱，用于土壤細(xì)菌多樣分析，另一部分土樣風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤基本理化性狀測(cè)定 土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、全磷、速效磷、速效鉀、pH測(cè)定分別采用半微量開(kāi)氏法、重鉻酸鉀容量法、堿解擴(kuò)散法、硫酸-高氯酸消煮 鉬銻抗比色法、Olsen法、NH4OAc浸提 火焰光度法測(cè)定，pH水土質(zhì)量比為5∶1[13]。

1.3.2 土壤微生物細(xì)菌總DNA的提取與檢測(cè) 土壤細(xì)菌DNA的提取采用Fast DNA Spin Kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。選擇細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū) (前引物序列ACTCCTACGGGAGGCAGCA，后引物序列GGACTACHVGGGTWTCTAAT，擴(kuò)增片段大小為500 bp。

反應(yīng)體系為：Q5反應(yīng)緩沖液 (5×)， Q5高保真GC緩沖液 (5× )， 0.25 μL，Q5高保真DNA聚合酶 (5 U/μL )，2 μL (2.5 mmol/L ) dNTPs、上下游引物 (10 μmol/L ) 各1.0 μL，2 μL DNA模板和8.75 μL ddH2O。擴(kuò)增程序： 98 ℃ 預(yù)變性2 min，98 ℃ 變性15 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延長(zhǎng)30 s，72 ℃終延伸5 min，10 ℃持續(xù)25～30個(gè)循環(huán)。對(duì)擴(kuò)增子純化后使用PicoGreen dsDNA Kit 分析試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA ) 進(jìn)行定量，通過(guò)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，再利用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。

采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格后的文庫(kù)利用Illumina MiSeq PE25測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端PE測(cè)序，委托天津諾和致遠(yuǎn)生物科技股份有限司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology,v1.8.0 ) 和R (v3.2.0 ) 軟件，調(diào)用USEARCH序列比對(duì)工具，對(duì)前述獲得的序列按97%相似度水平的OTUs (Operational Taxonomic Units ) 代表序列進(jìn)行生物學(xué)信息統(tǒng)計(jì)分析。利用Mothur軟件在97%的相似度水平下進(jìn)行OTUs聚類，統(tǒng)計(jì)獲得OTU的個(gè)數(shù)，得到每個(gè)OUT所對(duì)應(yīng)的物種分類學(xué)信息，統(tǒng)計(jì)觀察樣本數(shù)，計(jì)算樣品的覆蓋率指數(shù)。Mothur軟件計(jì)算Simpson和Shannon多樣性指數(shù)，Chao1和Ace豐富度指數(shù)，PD-whole tree等Alpha多樣性指數(shù)。通過(guò)UniFrac分析，評(píng)估樣本的Beta多樣性，根據(jù)樣本之間的加權(quán)(Weighted)的UniFrac距離矩陣進(jìn)行NMDS分析，繪制樣本聚類樹(shù)。細(xì)菌群落樣本組成之間的差異采用非度量多維尺度分析(Non-metric Multidimensional scaling，NMDS)和相似度分析檢驗(yàn)(ANOSIM)，通過(guò)基于999個(gè)排列的ANOSIM計(jì)算與NMDS相關(guān)的r值，NMDS和ANOSIM的計(jì)算均基于R 軟件Vegan 程序包。采用Microsof Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS 7.05軟件進(jìn)行單因素(LSD)方差分析比較差異顯著性(P<0.05)，采用 Canoco 5.0軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤基本理化性狀的 影響

連續(xù)有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥8 a后，除土壤C/N外(F=1.06，P=0.377)，土壤主要理化性狀指標(biāo)均極顯著受到土壤培肥方式的影響(P>0.001)(表1)；與T0相比，化肥配施較高量外源有機(jī)碳(T2、T3)下，土壤全氮分別增加64.00%和 56.00%；化肥配施較低量外源有機(jī)碳(T4、T5)下，土壤全氮均增加28.00%；但低量外源有機(jī)碳輸入下，土壤全氮的增幅明顯低于外源高量有機(jī)碳輸入處理。土壤堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也表現(xiàn)出與土壤全氮類似的變化趨勢(shì)?？梢?jiàn)，土壤全氮、堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低，明顯受到外源有機(jī)碳輸入數(shù)量及類型的影響，有機(jī)、無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥措施整體上增強(qiáng)土壤氮的容量和強(qiáng)度，以化肥配施高量外源有機(jī)碳(肥)的效果最好。

不同培肥措施下土壤全磷與T0間均顯著差異，但各培肥處理間無(wú)明顯差別。與T0相比，土壤速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也表現(xiàn)出與全磷類似趨勢(shì)。其中化肥配施高量外源有機(jī)碳處理下(T2、T3)，土壤速效磷較T0分別增加1.24倍、1.14倍，但T2、T3之間無(wú)顯著差異。外源低量有機(jī)碳輸入下，化肥配施生物有機(jī)肥、黃腐酸鉀肥料的處理與單施化肥處理間土壤速效磷也無(wú)顯著差異。不同培肥措施下土壤pH較T0下降0.07～0.14；T2、T3處理較T0土壤pH也分別降低2.51%、 2.05%。較高量外源有機(jī)碳輸入下，化肥配施牛糞(T2)、羊糞(T3)較化肥配施低量有機(jī)碳(T4、T5)土壤的pH僅分別下降0.61%～1.22%、 1.71%～2.32%。

土壤C/N是衡量土壤碳、氮營(yíng)養(yǎng)平衡狀況的指標(biāo)[14]。與T0相比，試驗(yàn)中有機(jī)與無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥措施均降低了土壤C/N，其下降平均在 4.41%～15.10%。分析認(rèn)為，試驗(yàn)中不同有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施在促進(jìn)土壤有機(jī)碳和全氮累積的同時(shí)，引起了土壤C/N的變動(dòng)；由于土壤C/N的變化與土壤養(yǎng)分循環(huán)與周轉(zhuǎn)直接相關(guān)，因此，土壤有機(jī)質(zhì)、有機(jī)氮的分解礦化以及土壤無(wú)機(jī)氮素的有效性必然與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化間存在著緊密的聯(lián)系。

表1 有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤理化性狀的影響Table 1 Effects of organic and inorganic fertilizer application on soil physicochemical properties

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異達(dá)顯著差異(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters within a column indicated significant difference(P<0.05).The same below.

2.2 有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性及組成的影響

表2中土壤有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施下各處理土壤樣品細(xì)菌文庫(kù)的覆蓋率均超過(guò)0.97，說(shuō)明土壤細(xì)菌的物種信息得到了較充分的體現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果能反映土壤細(xì)菌群落的真實(shí)情況。土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、Ace指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))在各處理之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。這說(shuō)明與對(duì)照相比，連續(xù)8 a的土壤培肥措施總體上并未顯著改變細(xì)菌群落的豐富度及多樣性。

表2 有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)細(xì)菌多樣性及豐富度的影響Table 2 Effects of organic fertilizer and inorganic fertilizer application to soil bacterial communitiy diversity and richness index

試驗(yàn)中總計(jì)36個(gè)土壤樣品共獲得的細(xì)菌序列46 531條，3 494個(gè)細(xì)菌OTUs，分屬于58門(mén)67綱143目271科639屬435種。相對(duì)豐度較高的前10門(mén)中變形菌門(mén) (Proteobacteria)，放線菌門(mén) (Actinobacteria)、酸桿菌門(mén) (Acidobacteria)、擬桿菌門(mén) (Bacteroidetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)的相對(duì)豐度均較高(圖1)。除了未確定門(mén)的其他細(xì)菌類群外，其余5門(mén)中綠灣菌門(mén)(Chloroflexi)所占比例分別為3.22%～ 4.86%，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為0.69%～ 6.11%、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)為0.006 8%～1.068%、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)為 1.26%～ 1.61%、奇古菌門(mén)為(Thaumarchaeota) 0.82%～1.79%，所占比例均較低。

變形菌門(mén)中，除T4與T0間的相對(duì)豐度無(wú)明顯差異外， T1、T2、T3、T5處理與T0相比，相對(duì)豐度分別提高5.18%、19.83%、11.91%、 9.90%，所占比例達(dá)37.76%～ 43.03%，變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)門(mén)(圖1)。與對(duì)照(T0)相比，外源較高量有機(jī)碳與化肥配施處理(T2、T3)的變形菌門(mén)相對(duì)豐度平均增幅為11.91%～19.83 % ，明顯高于低量外源有機(jī)碳和化肥配施以及單施化肥處理的增加幅度。酸桿菌門(mén)也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，但外源較低量有機(jī)碳配施化肥的情況下，酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度卻表現(xiàn)出較對(duì)照降低的趨勢(shì)，平均下降為10.52%～14.41%。不同處理下基于門(mén)水平上擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照處理都呈上升的趨勢(shì)；較低量外源有機(jī)碳和化肥配施處理中，其相對(duì)豐度為13.88%～15.40%，與較高量外源有機(jī)碳與化肥配施處理下的相對(duì)豐度相比，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度反而高出了10.70%、24.14%。

土壤細(xì)菌基于門(mén)水平上的相對(duì)豐度方差分析結(jié)果表明(圖1)，門(mén)水平上，單施化肥處理下，相對(duì)豐度較高的前10個(gè)門(mén)中土壤放線菌門(mén)(P= 0.001)、酸桿菌門(mén)(P=0.002)、芽孢桿菌門(mén)(P=0.013)、綠灣菌門(mén)(P=0.001)與對(duì)照間有極顯著性差異。牛糞配施化肥處理的土壤變形菌門(mén) (P=0.008 66)、放線菌門(mén)(P=0.002 7) 、綠灣菌門(mén)(P=0.000 13)與對(duì)照間有極顯著差異；而羊糞配施化肥下，則表現(xiàn)為變形菌門(mén)(P=0.032)、綠灣菌門(mén)(P=0.046)有顯著性差異。較高量有機(jī)碳及化肥配施下，細(xì)菌前10門(mén)的相對(duì)豐度中，除綠灣菌門(mén)(P=0.008 197)在牛糞配施化肥、羊糞配施化肥間有極顯著差異外，其他菌門(mén)間的相對(duì)豐度無(wú)明顯差異。較低量有機(jī)碳及化肥配施下，細(xì)菌前10門(mén)的相對(duì)豐度中各菌門(mén)的相對(duì)豐度間均無(wú)明顯差異，基于門(mén)水平上的細(xì)菌組成比較相似；但與對(duì)照相比，T4、T5處理也僅表現(xiàn)為綠灣菌門(mén)(P=0.026、P=0.029)有顯著性差異。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)是寧夏中部旱作區(qū)不同有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥模式下土壤的優(yōu)勢(shì)菌群；與對(duì)照相比，各有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥方式下的土壤樣品主要菌門(mén)的相對(duì)豐度之間存在差異。

根據(jù)Beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類分析，比較土壤細(xì)菌群落的相似性和差異關(guān)系可以看出(圖1)，6個(gè)處理可聚為4大類,其中T0、T1處理分別單獨(dú)聚為一類； T2和 T3處理的細(xì)菌群落聚類關(guān)系較近，聚為一類； T4、T5在聚類關(guān)系上也較近?？傮w上，低量外源有機(jī)碳配施化肥處理下土壤菌群結(jié)構(gòu)相似度與T0處理間較近，其與高量外源有機(jī)碳和化肥配施以及單施化肥處理間的差異較大；牛糞配施化肥與羊糞配施化肥處理間的土壤菌群結(jié)構(gòu)相似度較高。外源有機(jī)碳量的高低及有機(jī)肥料類型會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌群落相似性產(chǎn)生影響。

圖1 基于加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法的土壤細(xì)菌群落聚類分析及門(mén)水平上分類學(xué)組成和分布Fig.1 The clustering analysis of soil bacterial communities,the taxonomic composition and the distribution based on the phylum level by the method of Weighted Paired Arithmetic Mean(PGMA)

圖2 不同有機(jī)與無(wú)機(jī)培肥方式影響下的土壤細(xì)菌Beta多樣性非度量多維尺度分析Fig.2 Analysis of soil bacterial beta diversity of Nonmetric Multidimensional scaling(NMDS) under the treatment of organic fertilizer and chemical fertilizer application

采用非度量多維尺度分析(NMDS)來(lái)反映土壤細(xì)菌群落的Beta多樣性，結(jié)果表明(圖2)，對(duì)于基于門(mén)水平上的土壤細(xì)菌群落，不同有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施措施下各采樣點(diǎn)彼此間距離較近。整體上，T2、T3與T0的距離較T1和T4與T0間的距離稍遠(yuǎn)，這說(shuō)明中長(zhǎng)期有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施下，高量外源有機(jī)碳配施化肥(T2、T3)對(duì)土壤細(xì)菌Beta多樣性的影響較其他處理略高。通過(guò)對(duì)999個(gè)排列組合的相似性(ANOSIM)分析發(fā)現(xiàn)，與T0相比，有機(jī)、無(wú)機(jī)肥配施各措施對(duì)土壤細(xì)菌Beta多樣性的影響均顯著。其中T1與T0相比(ANOSIM，R=0. 94，P<0.01)、T2與T0相比(ANOSIM，R=1.00，P<0.01)、T3與T0相比(ANOSIM，R=0. 67，P<0.01)、T4與T0相比(ANOSIM，R=0.29，P<0.01)、T5與T0相比(ANOSIM，R=0. 35，P<0.01) 均有顯著性差異。但低量外源有機(jī)碳配施化肥的T4、T5之間(ANOSIM，R=-0.003，P=0.487)無(wú)顯著性差異。高量外源有機(jī)碳配施化肥的T2、T3之間(ANOSIM，R=0.33，P=0.006)有顯著性差異?？梢?jiàn)，有機(jī)、無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥方式以及外源有機(jī)碳類型在持續(xù)培肥下會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌群落組成產(chǎn)生顯著影響。

2.3 有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施下土壤細(xì)菌群落與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析

主成分分析(PCA)分析顯示了不同有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥方式下，土壤理化性質(zhì)與基于門(mén)水平上細(xì)菌相對(duì)豐度之間的關(guān)系(圖3)。第一排序軸、第二排序軸能分別在累積變量61.53%和17.14%上解釋相對(duì)豐度較高的前十門(mén)細(xì)菌群落的空間變化。變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度與土壤pH、土壤堿解氮呈負(fù)相關(guān)；厚壁菌門(mén)、梭菌門(mén)、奇古菌門(mén)的相對(duì)豐度與土壤pH、土壤堿解氮呈正相關(guān)；擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)碳間有正相關(guān)關(guān)系(圖3-A)。圖3-B中，土壤細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)以及ACE和Chao1豐富度指數(shù)均與土壤有機(jī)碳和堿解氮呈負(fù)相關(guān)。第一排序軸、第二排序軸分別解釋了土壤細(xì)菌豐富度、多樣性變化的87.82%和 9.67%。第一排序軸對(duì)不同有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施下的土壤細(xì)菌豐富度及多樣性的變化解釋量要比第二、三、四排序軸解釋量的總和還要大。

Chao1.Chao1指數(shù) Chao1 index;ACE.ACE指數(shù) ACE index；Shannon-香濃指數(shù) Shanno index;Simpson-辛普森指數(shù) Simpson index；pH；TN.土壤全氮 Total nitrogen；TP.土壤全磷 Total phouphorus);AP.土壤速效磷 Available phosphorus；AN.土壤堿解氮 Available nitrogen；AK.土壤速效鉀 Available potassium；OC.土壤有機(jī)碳 Organic carbon；C/N.土壤碳氮比 Ratio of soil carbon and nitrogen；N/P.土壤氮磷比 Ratio of soil nitrogen and phosphorus

圖3 基于門(mén)水平上土壤壤細(xì)菌相對(duì)豐度、多樣性與土壤理化性狀間的主成分分析
Fig.3 Principal component analysis(PCA) between relative abundance,diversity and richness of
soil bacterial communities based on phylum level and soil physical and chemical characteristics

3 討 論

3.1 有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)8 a有機(jī)、無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥方式，顯著提高了土壤主要理化性狀指標(biāo)中各養(yǎng)分的含量，化肥配施牛糞(T2)、羊糞(T3)等較高量外源有機(jī)碳處理對(duì)土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的效果較為顯著。相關(guān)研究也證實(shí)，單施化肥、有機(jī)肥配施化肥均能顯著提高土壤氮、磷等養(yǎng)分含量[15]；氮肥、磷肥結(jié)合的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)顯著增加了土壤總氮、有效氮、有效磷、總有機(jī)碳的含量[16]。分析認(rèn)為，由于土壤有機(jī)質(zhì)具有儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，驅(qū)動(dòng)微生物活動(dòng)和養(yǎng)分循環(huán)、促進(jìn)土壤物理性質(zhì)和保水能力等功能[17]。因此，培肥過(guò)程中，隨外源輸入有機(jī)碳數(shù)量的增加，有機(jī)、無(wú)機(jī)結(jié)合的方法促進(jìn)了植物枯落物、植物地下作物根茬以及根系分泌物來(lái)增加碳的輸入量，而輸入較高量外源有機(jī)肥也可以直接為土壤提供豐富的有機(jī)碳源。Hai等[17]也認(rèn)為，長(zhǎng)期有機(jī)肥施用對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的正效應(yīng)可歸因于有機(jī)肥的施用增加了土壤可提取的不穩(wěn)定態(tài)及礦物結(jié)合態(tài)有機(jī)質(zhì)庫(kù)的緣故。因此，土壤有機(jī)質(zhì)是直接和間接地影響土壤物理、化學(xué)、生物和土壤性質(zhì)的主要因子[18]。

土壤C/N可以反映土壤碳和氮循環(huán)中的復(fù)合效應(yīng)影響，通常用作估算土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量的參數(shù)，其與土壤硝化和有機(jī)質(zhì)的分解有關(guān)[19]。本試驗(yàn)中，有機(jī)肥、化肥配施有降低土壤C/N值的趨勢(shì)，但各處理間無(wú)顯著差異。相關(guān)研究認(rèn)為，低C/N的有機(jī)物質(zhì)輸入可以導(dǎo)致土壤碳的正啟動(dòng)效應(yīng)[19]。這意味著，可能由于牛糞、羊糞、生物有機(jī)肥往往具有相對(duì)較低的C/N，在化學(xué)氮肥施用量一定的情況下，隨外源有機(jī)碳的輸入，土壤微生物的分解速率加快。此外，土壤低C/N增加與碳循環(huán)有關(guān)酶的活性，相應(yīng)加速纖維素、木質(zhì)素和其他難以分解碳源的降解，進(jìn)一步提高碳的有效性和氮相關(guān)的酶活性，通過(guò)提高氮的礦化速率，增加無(wú)機(jī)氮的含量[20]。這也就解釋為什么外源有機(jī)肥配施化肥情況下，土壤C/N在不同培肥方式下均較低的原因。

3.2 有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

通常認(rèn)為，有機(jī)和無(wú)機(jī)肥料的施用會(huì)影響土壤微生物的多樣性、組成、豐富度和功能，各種有機(jī)物料的施用會(huì)對(duì)微生物多樣性產(chǎn)生不同的影響[21]。由于土壤細(xì)菌是土壤生產(chǎn)力的基礎(chǔ)，在土壤化學(xué)、物理性質(zhì)，包括養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)物分解等方面伴有重要的角色。因此，伴隨著施肥而引起土壤化學(xué)性狀的改變就會(huì)影響細(xì)菌群落的組成和多樣性[22]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，糞肥施用可以緩解長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥導(dǎo)致的細(xì)菌多樣性下降[23]。但本研究結(jié)果表明，連續(xù)8 a不同有機(jī)、無(wú)機(jī)配施的土壤培肥措施下土壤細(xì)菌的多樣性和豐度與對(duì)照處理間均無(wú)顯著差異。這與楊亞?wèn)|等[24]在長(zhǎng)期施肥(11 a)和灌溉對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響中發(fā)現(xiàn)，施有機(jī)肥和化肥處理的細(xì)菌群落ACE、Chao1 和香濃指數(shù)差異均不顯著的研究結(jié)果是一致的。但張凱煜等[25]研究認(rèn)為，肥料類型、施肥活動(dòng)與土壤微生物群落組成及其多樣性緊密相關(guān)，由于向土壤中人為大量輸入外源物質(zhì)從而導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性改變，有可能是導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性下降的主要原因。樊曉剛等[26]認(rèn)為，土壤微生物通常具有比較穩(wěn)定的多樣性特征，其多樣性一般比較穩(wěn)定，在土壤培肥過(guò)程中，短期土壤培肥，對(duì)土壤微生物的影響作用比較有限。隨培肥措施的應(yīng)用，盡管土壤氮、磷、鉀等無(wú)機(jī)元素和有機(jī)質(zhì)等可利用性增加，能為更多的微生物提供生長(zhǎng)和繁殖的條件，但由于土壤物理、化學(xué)性質(zhì)(例如土壤類型、pH、含鹽量)、作物品種、作物與微生物間的交互作用差異僅對(duì)特定細(xì)菌的發(fā)育產(chǎn)生較大影響[27]。 此外，目前的研究證實(shí)，土壤細(xì)菌的多樣性主要由土壤pH和空間距離決定[28]。土壤 pH 是土壤微生物生物量和細(xì)菌群落多樣性的限制因素[24]。因此，試驗(yàn)中同一試驗(yàn)地的不同有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施下盡管已實(shí)施8 a，但土壤pH的差異只有0.07～0.22，這可能是導(dǎo)致不同處理下土壤細(xì)菌多樣性只有極小差別，無(wú)顯著性差異的原因。

耕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化明顯依賴于土壤的理化性質(zhì)，如土壤pH[29]、土壤類型[30]和土壤有機(jī)物含量的變化[31]。因此，在不同的土壤培肥措施下土壤優(yōu)勢(shì)菌群就可能存在變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)、無(wú)機(jī)相結(jié)合的土壤培肥措施下，土壤變形菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，土壤變形菌門(mén)、 放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度均較高，無(wú)論高量或低量外源有機(jī)物與化肥配施均提高土壤變形菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低土壤放線菌門(mén)的相對(duì)豐度。Liu等[29]結(jié)果也證實(shí)畜禽糞便與化肥配合施用下土壤酸桿菌門(mén)，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)是土壤中普遍存在的主要類群。長(zhǎng)期施用有機(jī)肥料和化學(xué)肥料下土壤綠灣菌門(mén)、變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度的總和超過(guò)總序列的70%，是不同處理下的主要菌門(mén)[32]。施用化肥能引起某些細(xì)菌種群的變化，無(wú)機(jī)化肥的施用可導(dǎo)致a-變形桿菌和g-變形桿菌的增殖，降低古細(xì)菌和氯酸桿菌的相對(duì)豐度[16]。分析認(rèn)為，有機(jī)與無(wú)機(jī)肥配施增加土壤有機(jī)碳、全磷、速效磷等土壤養(yǎng)分，能消弱環(huán)境因子對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響。例如，試驗(yàn)中在有機(jī)與無(wú)機(jī)培肥結(jié)合后放線菌門(mén)相對(duì)豐度反而降低，是因?yàn)橥寥乐蟹啪€菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)多傾向于土壤有機(jī)質(zhì)含量較低的土壤中，而外源土壤有機(jī)碳的輸入及有機(jī)碳累積抑制了土壤放線菌門(mén)細(xì)菌的增長(zhǎng)[32]；變性菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)的細(xì)菌更適合于土壤養(yǎng)分含量相對(duì)較豐富的土壤，而導(dǎo)致相對(duì)豐度增加的趨勢(shì)。

相關(guān)研究證實(shí)，絕大多數(shù)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)都與土壤化學(xué)因子有一定的相關(guān)性[33]。本研究中，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)碳呈正相關(guān)；相對(duì)豐度較高的變形菌門(mén)等細(xì)菌類群與土壤pH、土壤堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。這同侯建偉等[34]在研究中得出變形菌門(mén)相對(duì)豐富度與土壤堿解氮呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)是一致的，但與土壤 pH 和 C/N與變形菌門(mén)極顯著正相關(guān)的結(jié)論正好相反。侯建偉等[34]認(rèn)為，由于細(xì)菌是土壤中最重要的分解者，因此長(zhǎng)期無(wú)機(jī)或有機(jī)肥料的施用會(huì)導(dǎo)致能有效利用土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的特定微生物的富集。通常而言，變形菌門(mén)細(xì)菌是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的共生性細(xì)菌，多存在于富含土壤有機(jī)碳的土壤條件下[28]。因此，化肥配施下，外源有機(jī)碳種類以及添加量高低導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量的增加，可能是通過(guò)影響土壤 pH、堿解氮等因子與土壤細(xì)菌菌群的相互作用，從而促進(jìn)參與分解過(guò)程的土壤細(xì)菌碳同化強(qiáng)弱來(lái)改變其群落組成的相對(duì)豐度。

4 結(jié) 論

變形菌門(mén)是中、長(zhǎng)期有機(jī)、無(wú)機(jī)培肥措施下土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，受外源有機(jī)碳輸入數(shù)量及有機(jī)肥類型的影響，基于門(mén)水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的相對(duì)豐度發(fā)生改變，但土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性在不同處理間無(wú)顯著差異。

土壤pH、土壤堿解氮、有機(jī)碳含量高低是驅(qū)動(dòng)基于門(mén)水平上土壤主要細(xì)菌類群相對(duì)豐度高低變化的主要影響因素。有機(jī)與無(wú)機(jī)相結(jié)合的培肥方式對(duì)提高土壤肥力，促進(jìn)旱作農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中合理施肥制度選擇具有重要作用。