何碧珀，趙 輝，劉紅彥，倪云霞，文 藝，劉新濤

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部農(nóng)作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

芝麻是世界上重要的優(yōu)質(zhì)油料作物，也是我國(guó)主要的油料作物之一，其種子油脂含量高且含有豐富的抗氧化物質(zhì)[1-7]。在我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)，芝麻莖點(diǎn)枯病、棒孢葉斑病、蠕孢葉斑病、枯萎病、球黑孢葉枯病等發(fā)生普遍，對(duì)芝麻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響[8]。目前，對(duì)芝麻真菌病害的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥為主[9-11]，但隨著人們生態(tài)環(huán)境保護(hù)和食品安全意識(shí)的不斷提高，生物防治因其不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)人畜安全，有利于環(huán)境保護(hù)等特點(diǎn)，成為植物病害防治的重要發(fā)展方向之一。

芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆能力和安全性，其在生物防治領(lǐng)域作為植物病害生防菌得到了廣泛的研究和應(yīng)用。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所篩選的枯草芽孢桿菌Bs-916，對(duì)水稻紋枯病田間防效穩(wěn)定在60%～81%，已進(jìn)行農(nóng)藥登記[12]；北京綠色農(nóng)華作物科技有限公司以貝萊斯芽孢桿菌Bv 01發(fā)酵液為活性成分研發(fā)的殺菌劑，能有效防治小麥赤霉病、花生白絹病和花生猝倒病，已獲得專利保護(hù)[13]。美國(guó)Agraquest公司利用枯草芽孢桿菌QST 713和QST 2808開(kāi)發(fā)的活菌劑Serenade TM和Sonata AS已在美國(guó)登記使用，用于防治土傳的絲核菌和鐮刀菌[14]；MARTINEZ等[15]用貝萊斯芽孢桿菌AH2制成的殺菌劑，不僅可以有效防治真菌性病害，還可刺激植物生長(zhǎng)。目前，關(guān)于芽孢桿菌在芝麻真菌病害防治方面的報(bào)道較少，且這些報(bào)道多數(shù)只針對(duì)單一病害。本研究以5種芝麻常見(jiàn)病原真菌為靶標(biāo)，對(duì)從采集的412份土壤樣品中篩選出的2株生防菌SFB34和SFB109進(jìn)行了廣譜抑菌活性測(cè)定和促生評(píng)價(jià)，并通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，為將菌株作為重要生防因子開(kāi)發(fā)和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

LB：胰蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL；PDA：新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 供試菌株

1.2.1 生防菌株及來(lái)源 2株生防菌：SFB34、SFB109，是前期從采集的412份土壤樣品中篩選出的，其中SFB34分離自欒川縣白巖寺村，SFB109分離自欒川縣秋扒鄉(xiāng)雁坎村。

1.2.2 供試病原真菌及來(lái)源 供試病原真菌：球黑孢(Nigrosporasphaerica)、多主棒孢(Corynesporacassiicola)、索氏平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生防實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 生防菌抑菌作用測(cè)定

采用PDA平板對(duì)峙法測(cè)定菌體的抑菌活性。在90 mm平板中央接種病原真菌作為指示菌，菌餅直徑6 mm，將生防菌接種在距指示菌2.5 cm的位置，以只接種病原真菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。待對(duì)照菌直徑介于7.5～8.0 cm時(shí)，用十字交叉法測(cè)定指示菌菌落半徑(Rc)和對(duì)峙培養(yǎng)的趨向半徑(Rp)，計(jì)算抑菌率[16]。抑菌率=(Rc-Rp)/Rc×100%。

采用含毒介質(zhì)法[17]測(cè)定菌株拮抗物質(zhì)的抑菌作用。PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右時(shí)，以發(fā)酵液濾液∶培養(yǎng)基=1∶3加至過(guò)濾的發(fā)酵液，充分混勻，倒板。待培養(yǎng)基凝固后，接種直徑6 mm的病原真菌菌餅于平板中央，以只接種病原真菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。待對(duì)照菌菌落直徑介于7.5～8.0 cm時(shí)，測(cè)量對(duì)照和處理菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-6)×100%。

1.4 促生作用測(cè)定

1.4.1 生防菌菌懸液制備 挑取活化好的生防菌單菌落到LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌水洗2～3次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌懸液稀釋到5×108cfu/mL。

1.4.2 生防菌對(duì)芝麻苗的促生作用測(cè)定 以芝麻為指示植物，采用盆栽方式，挑選飽滿的芝麻種子在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽24 h后播種于無(wú)菌土壤中。待芝麻苗生長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)定苗，每盆留4棵長(zhǎng)勢(shì)一致的芝麻苗。設(shè)置2個(gè)處理，處理1為空白對(duì)照(CK)，用無(wú)菌水灌根，每株灌5 mL；處理2用5×108cfu/mL菌懸液灌根，每株灌5 mL。每個(gè)處理16棵芝麻苗，重復(fù)3次。將處理好的芝麻苗放置于光照溫室中，28～32 ℃培養(yǎng)，定期澆水。培養(yǎng)21 d后調(diào)查芝麻苗的生長(zhǎng)情況，記錄株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量以及干質(zhì)量。

1.5 生防菌鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察和生理生化測(cè)定 觀察生長(zhǎng)于LB平板上的菌株的菌落形態(tài)；通過(guò)革蘭氏染色觀察其個(gè)體特征；參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]測(cè)定菌株SFB34和SFB109的生理生化相關(guān)指標(biāo)。

1.5.2 分子鑒定 生防菌的全基因組利用CTAB法提取。PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增采用25 μL體系：Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送鄭州尚亞公司測(cè)序。將獲得的序列利用BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)，檢索出相似性高且具有代表性的菌株。用BioEdit 7.0軟件對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)，再用MEGA 4.0軟件以鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步對(duì)生防菌株進(jìn)行鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013、DPS 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109抑菌效果

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SFB34和SFB109對(duì)供試的5種芝麻病原真菌抑菌效果較好(圖1)，抑菌率均大于50%(表1)。SFB34抑菌率由大到小排序：球黑孢(75.00%)>多主棒孢(67.86%)>索氏平臍蠕孢(60.00%)>尖鐮孢(56.43%)>菜豆殼球孢(54.71%)；SFB109抑菌率由大到小排序：多主棒孢(71.79%)>索氏平臍蠕孢(62.65%)>菜豆殼球孢(61.18%)>尖鐮孢(55.71%)>球黑孢(55.00%)。

1—5：陽(yáng)性對(duì)照依次為菜豆殼球孢、尖鐮孢、索氏平臍蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌；6—10：依次接入菜豆殼球孢、尖鐮孢、索氏平臍蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌，再分別接入SFB34；11—15：在含SFB34發(fā)酵液濾液的培養(yǎng)基上依次接入菜豆殼球孢、尖鐮孢、索氏平臍蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌；16—20：依次接入菜豆殼球孢、尖鐮孢、索氏平臍蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌，再分別接入SFB109；21—25：在含SFB109發(fā)酵液濾液的培養(yǎng)基上依次接入菜豆殼球孢、尖鐮孢、索氏平臍蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌1—5: The positive control is Macrophomina phaseolina,Fusarium oxysporum,Bipolaris sorokiniana,Corynespora cassiicola and Nigrospora sphaerica in

含毒介質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，菌株SFB34和SFB109的發(fā)酵液濾液抑菌率分別介于47.13%～88.89%、38.84%～86.90%，其對(duì)菜豆殼球孢、索氏平臍蠕孢和球黑孢的抑菌率均在83%以上；菌株SFB34對(duì)尖鐮孢、多主棒孢的抑菌率分別為47.13%、59.33%，SFB109對(duì)尖鐮孢、多主棒孢的抑菌率分別為38.84%、69.49%，2個(gè)菌株對(duì)尖鐮孢和多主棒孢的抑菌率較低，與其對(duì)菜豆殼球孢、索氏平臍蠕孢和球黑孢的抑菌率差異均達(dá)到顯著水平。

表1 2種生防菌對(duì)芝麻病原真菌的抑菌率Tab.1 Inhibition rates of two biocontrol bacteria against sesame pathogenic fungi

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109對(duì)芝麻苗的促生效果

促生效果測(cè)定結(jié)果表明(圖2)，21 d后2株生防菌對(duì)芝麻苗的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的促生作用。與對(duì)照相比(表2)，SFB34和SFB109對(duì)芝麻苗的株高和鮮質(zhì)量均有較大影響，株高分別增長(zhǎng)了8.91%、8.57%，鮮質(zhì)量分別增長(zhǎng)了28.02%、20.88%，與對(duì)照相比差異均達(dá)到顯著水平。SFB34對(duì)芝麻苗的根長(zhǎng)影響較大，根長(zhǎng)增長(zhǎng)了22.42%，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平；而SFB109對(duì)芝麻苗的根長(zhǎng)影響較小，根長(zhǎng)增長(zhǎng)了13.16%，與對(duì)照相比差異未達(dá)到顯著水平。SFB34和SFB109對(duì)芝麻苗的干質(zhì)量均有較大影響，干質(zhì)量分別增長(zhǎng)了23.52%、11.76%，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平。綜上所述，5×108cfu/mL的SFB34和SFB109菌懸液對(duì)芝麻促生效果明顯。

圖2 菌株SFB34和SFB109對(duì)芝麻苗的促生效果Fig.2 Promoting effects of strains SFB34 and SFB109 on sesame seedlings

表2 菌株SFB34和SFB109菌懸液對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of suspension of SFB34 and SFB109 on the growth of sesame seedlings

2.3 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示(圖3)，菌株SFB34和SFB109菌體呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色均呈陽(yáng)性，在LB平板上菌落乳白色，邊緣不整齊，表面干燥，不透明，SFB109表面有褶皺和凸起。由表3可知，SFB34和SFB109的甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、精氨酸雙水解試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素水解試驗(yàn)、酪氨酸水解試驗(yàn)、葡聚糖水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性，幾丁質(zhì)水解試驗(yàn)均為陰性。碳源利用方面的試驗(yàn)表明，SFB34和SFB109均可利用蔗糖、D-葡萄糖、D-果糖，SFB34還可以利用麥芽糖、乳糖、D-木糖、甘油、D-山梨醇和D-甘露醇，而SFB109則無(wú)法利用。參照文獻(xiàn)[7]，結(jié)合菌株SFB34和SFB109的形態(tài)特征、染色結(jié)果和生理生化測(cè)定結(jié)果，可判定SFB34和SFB109為芽孢桿菌。

A：SFB34菌落形態(tài); B：SFB109菌落形態(tài); C：SFB34革蘭氏染色; D：SFB109革蘭氏染色

項(xiàng)目ItemSFB34SFB109項(xiàng)目ItemSFB34SFB109甲基紅試驗(yàn)Methyl-Redtest++碳源利用試驗(yàn):麥芽糖Carbonsourceutilizationtest:Maltose+-乙酰甲基甲醇試驗(yàn)Voges-Proskauertest++碳源利用試驗(yàn):乳糖Carbonsourceutilizationtest:Lactose+-過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)Catalasetest++碳源利用試驗(yàn):蔗糖Carbonsourceutilizationtest:Sucrose++明膠水解試驗(yàn)Gelatinhydrolysatetest++碳源利用試驗(yàn):D-葡萄糖Carbonsourceutilizationtest:D-Glucose++精氨酸雙水解試驗(yàn)Argininedihydrolysistest++碳源利用試驗(yàn):D-木糖Carbonsourceutilizationtest:D-Xylose+-淀粉水解試驗(yàn)Starchhydrolysistest++碳源利用試驗(yàn):D-果糖Carbonsourceutilizationtest:D-Fructose++幾丁質(zhì)水解試驗(yàn)Chitinhydrolysistest--碳源利用試驗(yàn):甘油Carbonsourceutilizationtest:Glycerol+-纖維素水解試驗(yàn)Cellulosehydrolysistest++碳源利用試驗(yàn):D-山梨醇Carbonsourceutilizationtest:D-Sorbitol+-酪氨酸水解試驗(yàn)Tyrosinehydrolysistest++碳源利用試驗(yàn):D-甘露醇Carbonsourceutilizationtest:D-Mannitol+-葡聚糖水解試驗(yàn)Dextranhydrolysistest++

注：+表示陽(yáng)性；-表示陰性。

Note: + means positive; - means negative.

將菌株SFB34和SFB109用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，序列長(zhǎng)度分別為1 422、1 436 bp。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株SFB34和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis，登錄號(hào)為MK_156148.1、MK_610724.1) 的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似度為100%；菌株SFB109和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，登錄號(hào)為：MH_187616.1)16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似度為98.89%。根據(jù)16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)表明，SFB34與貝萊斯芽孢桿菌聚為一支，SFB109與枯草芽孢桿菌聚為一支。因此，根據(jù)同種細(xì)菌同源性相似度不低于98.65%的標(biāo)準(zhǔn)[19]，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，SFB34和SFB109分別被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。

圖4 基于16S rDNA序列同源性分析構(gòu)建的菌株SFB34和SFB108系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of SFB34 and SFB108 based on 16S rDNA sequence homology analysis

3 結(jié)論與討論

在芝麻真菌病害生防菌的篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)菌株SFB34和SFB109有良好的抑菌效果，通過(guò)生理生化、形態(tài)觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，將菌株SFB34和SFB109分別鑒定為貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。芽孢桿菌具有抑菌譜廣、繁殖能力和抗逆性強(qiáng)、防病促生等基本特性，被廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治領(lǐng)域。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)生抗真菌代謝產(chǎn)物以及在植物上高效定殖的特點(diǎn)，許多菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被用作植物病原菌的拮抗劑和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑[20]。貝萊斯芽孢桿菌對(duì)梨灰霉和青霉病菌[21]、小麥赤霉病菌[22]、小麥白粉病菌[23]、馬鈴薯枯萎病菌[24]、稻瘟菌[25]等植物病害有很好的拮抗效果；KANJANAMANEESATHIAN等[26]將貝萊斯芽孢桿菌制成的懸浮劑直接應(yīng)用于萵苣幼苗，發(fā)現(xiàn)其不僅能有效控制萵苣根腐病，還能促進(jìn)萵苣生長(zhǎng)；蔡長(zhǎng)平等[27]報(bào)道貝萊斯芽孢桿菌PEB-99不僅對(duì)辣椒青枯雷爾氏菌、辣椒疫霉菌和辣椒炭疽病菌等有顯著抑菌效果，該菌還能產(chǎn)生鐵載體和吲哚-3-乙酸，溶解有機(jī)磷，顯示出很好的抗病促生長(zhǎng)潛力?？莶菅挎邨U菌是世界農(nóng)藥市場(chǎng)上近一半生物農(nóng)藥的活性成分，被廣泛應(yīng)用于棉花、小麥、水稻、辣椒等作物真菌病害的生物防治[28]。LEE等[29]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌21-1不僅能提高種子發(fā)芽率，還能有效防治黃瓜葉片炭疽病、番茄灰霉病、大白菜和生菜軟腐?。籝U等[30]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌CAS15可使辣椒枯萎病降低12.5%～56.9%，還能將花期縮短一半，使辣椒株高增加27.24%～54.53%，單果質(zhì)量增加36.92%，單株產(chǎn)量增加49.68%。本研究中平板對(duì)峙法和含毒介質(zhì)法測(cè)定SFB34和SFB109對(duì)芝麻球黑孢、多主棒孢、索氏平臍蠕孢、尖鐮孢和菜豆殼球孢5種病原真菌的抑菌效果表明，2個(gè)菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性，其中SFB34和SFB109的發(fā)酵液濾液對(duì)菜豆殼球孢、索氏平臍蠕孢和球黑孢的抑菌率達(dá)83%以上，高于菌體抑菌率，而SFB34和SFB109的發(fā)酵液濾液對(duì)多主棒孢和尖鐮孢的抑菌率均低于菌體抑菌率，這可能是由于菌株在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)不同引起的。另外，用5×108cfu/mL的SFB34和SFB109菌懸液分別灌根處理芝麻苗后，與對(duì)照相比，芝麻苗的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著提高。

大量研究表明，芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，主要有抑菌蛋白、抗生素、細(xì)胞壁溶解酶、細(xì)菌素以及揮發(fā)性物質(zhì)等。本研究中的SFB34和SFB109具有纖維素水解、酪氨酸水解、葡聚糖水解的能力，并且其發(fā)酵液濾液對(duì)上述芝麻病原真菌也有很好的抑制效果，據(jù)此推測(cè)上述2個(gè)菌株的發(fā)酵液濾液中可能含有細(xì)胞壁溶解酶和一些抑菌蛋白等，具體活性物質(zhì)成分還有待進(jìn)一步研究。