李蕓芳 李竣

摘要：指出了天然藥物化學(xué)開放性實驗?zāi)芗ぐl(fā)學(xué)生對天然藥物化學(xué)理論知識的學(xué)習(xí)興趣，提升學(xué)生的實驗技能和創(chuàng)新能力。以皺皮木瓜中多糖的提取及其單糖成分的測定為例，進行了開放性實驗教學(xué)改革的研究。結(jié)果表明：通過讓學(xué)生自主查閱文獻，獨立設(shè)計實驗方案，對實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果進行分析討論，將理論知識與實踐相結(jié)合，不僅增強了學(xué)生的動手能力，還充分調(diào)動了學(xué)生的主觀能動性，取得了良好的教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：開放性實驗;天然藥物化學(xué);多糖;皺皮木瓜

中圖分類號：G642 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）17-0264-04

1引言

天然藥物化學(xué)是高等院校藥學(xué)專業(yè)的一門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課程，它是運用現(xiàn)代技術(shù)和方法研究天然藥物化學(xué)成分的一門科學(xué)，研究內(nèi)容主要包括天然產(chǎn)物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點、理化性質(zhì)、提取分離方法以及結(jié)構(gòu)鑒定等。天然藥物化學(xué)實驗是天然藥物化學(xué)教學(xué)中必不可少的環(huán)節(jié)，是使學(xué)生進一步理論聯(lián)系實際，培養(yǎng)科研興趣和實驗?zāi)芰Φ闹匾緩健?/p>

目前，天然藥物化學(xué)實驗大多采用傳統(tǒng)的教學(xué)方式：指導(dǎo)教師通過講座方式講解實驗內(nèi)容、實驗步驟和注意事項，學(xué)生再參照實驗講義按部就班地進行實驗操作。傳統(tǒng)教學(xué)模式的優(yōu)點是：實驗授課集中統(tǒng)一，便于教學(xué)管理，實驗內(nèi)容易于標(biāo)準(zhǔn)化;節(jié)約教學(xué)成本等。但這種模式也存在明顯的不足之處：多以驗證性實驗為主，缺少探索性和趣味性;學(xué)生被動參與已擬定好的實驗方案，從而缺少主觀能動性;實驗內(nèi)容比較簡單，大多只涉及基礎(chǔ)操作，缺少挑戰(zhàn)性和創(chuàng)新性。與傳統(tǒng)實驗教學(xué)模式不同，開放性實驗是學(xué)生根據(jù)實驗要求親自參與設(shè)計實驗方案，并驗證方案可行性的自主性探究，具有以學(xué)生為中心、幫助學(xué)生自主學(xué)習(xí)、培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維能力、調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)積極性等優(yōu)點，成為近年來實驗教學(xué)改革的研究熱點。

多糖化學(xué)成分是天然產(chǎn)物中具有藥理活性的一個大家族，也是天然藥物化學(xué)課程中的重點授課內(nèi)容之一。多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖具有多種藥理活性，比如抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、提高機體免疫力等作用。多糖的種類、結(jié)構(gòu)和分子量大小對其藥理作用有直接和間接的影響。本文以皺皮木瓜中多糖的提取和單糖的組成測定為例，進行了開放性實驗項目的教學(xué)改革嘗試。

2開放性實驗的流程

在整個開放性實驗中以學(xué)生為主體，指導(dǎo)教師起到引導(dǎo)和協(xié)助作用。圖1所示為本實驗項目的流程圖：第一步，教師指定實驗題目。在實驗前，根據(jù)實驗室的儀器設(shè)備和（或）實驗材料等硬件條件給學(xué)生劃定一定的實驗范圍。指導(dǎo)教師劃定一個大概的范圍后，可以避免題目太大，令學(xué)生無所適從，也可避免學(xué)生制定的實驗方案因客觀條件不足而無法開展。該項目指定的實驗題目為“皺皮木瓜中多糖的提取和單糖成分測定”。第二步，由學(xué)生分析實驗題目，領(lǐng)會實驗要求。分析題目后，學(xué)生可明晰實驗的研究對象是什么，實驗要做哪些內(nèi)容，實驗的技術(shù)手段有沒有限制等信息。比如上述實驗題目的研究對象為“皺皮木瓜中的多糖”，并限定了實驗內(nèi)容，即“提取”和“分離”皺皮木瓜中的多糖并“測定”其中的單糖成分。此外，對采用的技術(shù)手段沒有限制，給學(xué)生留下了靈活探索實驗的余地和空間。第三步，由學(xué)生提出可能的實驗方案。在學(xué)生領(lǐng)會了實驗要求后，就要著手處理“怎么完成實驗”這個總的問題，圍繞這個總的問題又產(chǎn)生了一系列細節(jié)問題，比如“多糖有哪些提取方法？提取的原理是什么？哪種方法高效便捷？”、“多糖的分離手段有哪些？”、“多糖如何檢測？檢測手段有哪些？”等。這些問題可在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生通過查閱資料和文獻找到答案，然后由學(xué)生提出可能的實施方案和計劃。在這個環(huán)節(jié)中，可充分調(diào)動學(xué)生的主觀能動性，讓學(xué)生帶著疑問和好奇心開始學(xué)習(xí)和探索，激發(fā)學(xué)習(xí)興趣。第四步，師生通過共同討論確定實驗方案。由于指導(dǎo)教師具備豐富的實驗經(jīng)驗，在方案的確定上，需要通過討論的方式協(xié)助學(xué)生確定實驗方案，實驗方案的選擇主要考慮到實驗硬件設(shè)施是否具備，實驗材料是否易得，實驗操作步驟是否復(fù)雜，實驗方法是否可行等方面，綜合考慮后確定實驗方案，學(xué)生以撰寫實驗預(yù)習(xí)報告的形式制定實驗計劃。第五步，完善實驗方案的細節(jié)，準(zhǔn)備實驗材料。假如方案里采用“膜分離”法分離和純化多糖，那么計劃用哪種孔徑的濾膜進行實驗？如果采用“高效液相色譜法”對多糖進行測定，檢測波長選擇多少納米？可參考的流動相成分及配比是怎樣的？諸如此類實驗細節(jié)的確定為進入下一步實驗環(huán)節(jié)提供了極強的操作性。第六步，按照已制定的實驗方案，進行實驗操作。本環(huán)節(jié)是整個實驗的主體部分，指導(dǎo)教師需要給學(xué)生進行講解和示范儀器設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)操作，以使學(xué)生掌握儀器的使用方法。其他實驗步驟由學(xué)生自主獨立完成。教師對實驗進行監(jiān)督和指導(dǎo)，重在啟發(fā)和引導(dǎo)，培養(yǎng)學(xué)生動手能力。在實驗過程中，要求學(xué)生有條理地記錄實驗條件、實驗步驟、實驗現(xiàn)象和實驗結(jié)果等數(shù)據(jù)，培養(yǎng)嚴謹?shù)膶嶒灹?xí)慣。第七步，實驗結(jié)果的分析討論和總結(jié)。該步對培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力非常重要。開放性實驗重在培養(yǎng)學(xué)生探索研究的能力，對于實驗結(jié)果的好壞并沒有那么嚴格，即使實驗結(jié)果不理想，教師鼓勵學(xué)生對結(jié)果進行大膽的討論和分析，協(xié)同學(xué)生一起找出原因和可能的解決方案，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)造性解決問題的能力。最后由學(xué)生對實驗做出書面總結(jié)，提交實驗報告給指導(dǎo)老師批閱。

3實驗安排

本實驗計劃學(xué)時為50個學(xué)時，學(xué)生每組5人。學(xué)生利用周一至周五課外時間以及周末在開放的本科教學(xué)基礎(chǔ)實驗室、光譜實驗室以及色譜實驗室進行實驗。

4實驗方案的設(shè)計與實施

本開放性實驗的主要目的是讓學(xué)生了解和掌握多糖的提取分離和純化方法以及多糖的檢測方法，幫助學(xué)生鞏固天然藥物化學(xué)理論課上學(xué)到的基本知識和實驗原理。通過該實驗課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生掌握1～2種多糖提取分離的常用方法，熟悉膜分離技術(shù)、柱層析技術(shù)等，對糖類成分的衍生化以及紫外分光光度法和高效液相色譜法等檢測方法也有較為深入的了解和實踐。在現(xiàn)有實驗室提供的實驗條件基礎(chǔ)上，由學(xué)生自行設(shè)計實驗方案和計劃、完成實驗內(nèi)容，并寫出實驗報告。全面培養(yǎng)學(xué)生自主創(chuàng)新和動手能力，提高高等院校的人才培養(yǎng)質(zhì)量。

4.1實驗材料及儀器設(shè)備

實驗所需皺皮木瓜為湖北長陽縣皺皮木瓜干燥果實，經(jīng)中南民族大學(xué)生科院劉虹副教授鑒定為薔薇科木瓜屬皺皮木瓜（C.speciosa Sweet Nakai），樣品（No：201704）存放于中南民族大學(xué)藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究室。另需實驗試劑有無水乙醇、三氟乙酸、二氯甲烷、色譜純乙腈、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硼氫化鈉、L-cysteinemethyl ester hydrochloride（L-半胱氨酸甲基酯）、0-tolyl isothiocyanate（鄰苯甲異氰酸酯）、吡啶、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖等。

儀器設(shè)備有：氮吹儀（MTN-2800D型，上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）、冷凍干燥機（FD-1B-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠）、水浴鍋（WB-2000型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、循環(huán)真空泵（Z-III型，上海亞榮生化儀器廠）、紫外分光光度儀（UECl312028型，上海美普達儀器有限公司），電冰箱（BCD-228SDPW型，海爾有限公司）、電子精密天平（JAll003N型，鄭州時代儀器設(shè)備有限公司）、大孔樹脂（D-101型，天津普拉德生物科技有限公司）、超濾杯（MSC300型，上海摩速科學(xué)器材有限公司）、高效液相色譜儀（ULTIMATE 3000型，美國戴安公司）。

4.2皺皮木瓜中多糖的提取分離和純化

4.2.1多糖的初步提取

經(jīng)查閱資料后，學(xué)生了解到：在提取植物中的多糖時，現(xiàn)今的技術(shù)主要有水提法，酶解提取法，超聲波提取法，以及微波提取法等。水提法是一種常見的提取辦法，主要為稱取一定的樣品粉末后，通過在水中回流進行初步提取。該方法簡便易行，遂采取水提回流法對皺皮木瓜中的多糖成分進行初步提取，提取方法如下：將新鮮的皺皮木瓜曬干，粉碎，過10目篩，用乙醇提取，干燥。稱取90g皺皮木瓜粉末，按料液比1：10（質(zhì)量體積比）加入超純水，于95℃回流提取3次，每次1h，抽濾，合并提取液，加入無水乙醇至醇濃度為70%，于4℃條件下靜置24h，4000r/min離心5min，將下層沉淀冷凍干燥，將凍干后固體溶解，并與Sevage試劑（氯仿：正丁醇=5：1）按4：1充分混勻，震蕩20rain，4000r/rain離心15min，收集上清液，除去多糖溶液層與有機溶液層間的白色膠狀物，重復(fù)數(shù)次直至沒有膠狀物，懸蒸干燥，得到多糖粗提物。該粗提物溶液在200～800nm的波長范圍內(nèi)測量紫外吸收，對比除蛋白前的樣品的吸收曲線。

4.2.2多糖的純化

多糖的分離純化有季銨鹽沉淀法、離子交換色譜、纖維素柱色譜、凝膠柱色譜等方法，學(xué)生結(jié)合實驗室現(xiàn)有條件，選擇了膜分離法對粗糖物質(zhì)進行分離純化。

膜分離技術(shù)（Membrane Separation Technique）是利用天然或人工合成的具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力對雙組分或多組分混合的氣體和液體進行分離，從而達到分離分級純化濃縮目的的一門新興的高效分離技術(shù)。學(xué)生通過查閱國內(nèi)外文獻，了解到膜分離技術(shù)的原理和發(fā)展概況，了解到膜分離有耗能小、分離效率高、無二次污染等優(yōu)點。并調(diào)查了天然產(chǎn)物主要成分的相對分子量（表1），制定了膜分離實驗的工藝路線圖（圖2）。

4.3單糖的組成及含量比的測定

4.3.1糖的衍生化反應(yīng)

單糖在紫外下沒有吸收，如要用紫外檢測器來進行單糖種類鑒別，則需讓糖發(fā)生衍生化反應(yīng)連上生色團。粗糖用TFA水溶液水解，后與L一半胱氨酸甲酯水解糖的無水吡啶溶液反應(yīng)，最后加入鄰甲苯基異硫氰酸酯到混合物中，進一步加熱反應(yīng)得最終產(chǎn)物。反應(yīng)原理如圖3所示。

4.3.2高效液相色譜法檢測

由于糖的衍生化反應(yīng)使得糖分子連接上去了生色團，使最大吸收波長紅移，故能在紫外波長280nm下顯示吸收，可以采用高效液相色譜法進行檢測。用D一阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖作為標(biāo)準(zhǔn)單糖來對比得出樣品中的單糖種類構(gòu)成及其含量比。

（1）實驗步驟。

用混合標(biāo)準(zhǔn)品在紫外下進行全波段掃描找出最大吸收波長為250nm。取樣品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖和D-半乳糖各10mg。并設(shè)置不加任何糖的空白對照。將樣品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖和空白對照分別用4tool/L的TFA水溶液10mL于95℃水浴中水解3h，后減壓蒸發(fā)下除去TFA。水解產(chǎn)物溶解于5mL無水吡啶，加入10mg L-半胱氨酸甲酯?；旌弦涸谒』亓?.5h，后加入50uL鄰甲苯基異硫氰酸酯到混合溶液中，60°C加熱1h，反應(yīng)后混合物用氮吹儀吹干，并用5mL二甲基亞砜溶解。將D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D一半乳糖各取0.5mL混合制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，另將混合標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.5mL二甲基亞砜使得其體積為3.5mL。

經(jīng)上述處理的樣品粗糖，D-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，混合標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照7組分別按下面按液相條件進樣分析。

（2）液相條件。

色譜柱：Agilent HC-C18，4.6×250mm;流動相：25%CH3CN-H20（含1‰TFA）;柱溫30℃;流速：0.8mL/min檢測波長：280nm;進樣體積：5uL。

5實驗結(jié)果的討論與分析

5.1多糖的提取率

學(xué)生根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析得知此皺皮木瓜樣品的多糖的含量僅為2.16%。在具體實驗中，經(jīng)Sevag法除蛋白，膜分離后，樣品剩余0.80g，則得出多糖的提取率為41.15%。討論分析提取率偏低的可能原因為：用Sevag法時，把蛋白層剔除時有部分多糖與蛋白一起剔除，這個過程應(yīng)該是多糖損失的最主要步驟，此外，實驗中綜合考慮后，選取規(guī)格是3500的超濾膜對多糖進一步純化，這就使分子量低于3500內(nèi)的多糖成分流出透析袋，最后留下的是分子量在3500以上的大分子糖類，減少了多糖的含量。這些都是造成多糖提取率偏低的原因。

5.2單糖成分檢測結(jié)果

圖5是對混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品粗糖衍生化反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC分析圖。圖5A中，D一阿拉伯糖（RT=29.80min），D-葡萄糖（RT=24.98min），D-木糖（RT=28.29min），D-半乳糖（RT=21.80min）。圖6B中能匹配上混合標(biāo)準(zhǔn)品峰的有兩個，對應(yīng)的保留時間分別為RT=21.81min，RT=27.52min，即為D-半乳糖和D-木糖。

混合標(biāo)準(zhǔn)品由2mg/mL D-阿拉伯糖，2mg/mL D一葡萄糖，2mg/mL D-木糖和2mg/mLD-半乳糖分別取0.5mL，并加二甲基亞砜稀釋至3.5mL所得，故混標(biāo)中，D-木糖和D-半乳糖的濃度都為0.3mg/mL。液相分析時，每次進樣量為5UL，故每次進樣的質(zhì)量為1.5×10^-3mg。

設(shè)進樣的5uL樣品中D一半乳糖的質(zhì)量為M1，其物質(zhì)量為N1。D-木糖的質(zhì)量為M2，其物質(zhì)量為N1。根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)和單糖質(zhì)量根據(jù)公式：標(biāo)準(zhǔn)峰面積/多糖水解液中對應(yīng)單糖峰面積一標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量/多糖水解液中對應(yīng)單糖質(zhì)量，可計算得到多糖中D一半乳糖和D一木糖的質(zhì)量。根據(jù)這兩種單糖的分子量，可計算出皺皮木瓜中這兩種單糖的摩爾比為1：4.8。

討論和分析：通過高效液相色譜法分析皺皮木瓜多糖的單糖組成至少為D-半乳糖，D-木糖兩種，通過圖5中B可知，樣品中還有其他未知的峰，可能還有其他單糖的存在，皺皮木瓜多糖的單糖組成可在此實驗基礎(chǔ)之上通過使用更多的單糖標(biāo)準(zhǔn)品對比，獲得更詳盡的單糖組成信息。

6結(jié)語

開放性實驗教學(xué)是教學(xué)改革的重要舉措，培養(yǎng)學(xué)生的主體性是實驗教學(xué)改革實現(xiàn)的有效途徑，也是提高學(xué)生實驗技能、培養(yǎng)學(xué)生綜合能力的有力保障，應(yīng)充分發(fā)揮學(xué)生主體性作用在高校人才培養(yǎng)中的重要作用。本文以“皺皮木瓜中多糖的提取和單糖成分測定”為例，嘗試了教學(xué)模式的改革，通過開放性實驗教學(xué)，大大提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)了學(xué)生主動學(xué)習(xí)的能力，對所學(xué)的天然藥物化學(xué)知識有了感性直觀的理解和認識，同時，由于本課程中的紫外分光光度法和高效液相色譜法是藥物分析實驗課程的內(nèi)容，同學(xué)們將所學(xué)的藥物分析課程的知識應(yīng)用到了天然藥物化學(xué)實驗上，增強了藥學(xué)專業(yè)知識的交叉滲透，使學(xué)生可以融匯貫通，學(xué)以致用。