王衛(wèi)強(qiáng), 羅 超, 張海娟， 杜勝男， 李 佳

(遼寧石油化工大學(xué) 石油天然氣工程學(xué)院，遼寧 撫順113001)

石蠟是一種含有正構(gòu)烷烴、異構(gòu)烷烴和環(huán)烷烴的復(fù)雜混合物[1]。當(dāng)含蠟原油在開(kāi)采與運(yùn)輸過(guò)程中的溫度降至析蠟點(diǎn)時(shí)，油流中的蠟組分結(jié)晶析出、沉積在輸油管壁上，致使管道有效流通面積減小，管道輸送能力下降[2]。此外，長(zhǎng)期在低溫環(huán)境下輸送含蠟原油會(huì)帶來(lái)管道堵塞的安全隱患[3-5]。微生物清防蠟方法可降低原油蠟含量，減少蠟沉積，提高原油流動(dòng)性[5]，具有高效環(huán)保[6]、作用周期長(zhǎng)、成本低等特點(diǎn)[7]，已成為研究熱點(diǎn)。尤其隨著三次采油技術(shù)的迅速發(fā)展，依靠傳統(tǒng)方法來(lái)解決含蠟原油在開(kāi)采和運(yùn)輸過(guò)程中面臨的難度和生產(chǎn)成本問(wèn)題已越來(lái)越不能滿足要求[8]，從而，促進(jìn)了微生物清、防蠟技術(shù)在含蠟原油開(kāi)采和運(yùn)輸中的應(yīng)用。

針對(duì)大慶含蠟原油特點(diǎn)，筆者從石油污染的土壤中分離出一株嗜蠟菌，考察了其除蠟降黏效果,測(cè)定了其代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑種類的性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料及試劑

含蠟原油樣品來(lái)自于大慶油田，蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.6%，密度為872 kg/m3，在37 ℃條件下表觀黏度為2614 mPa·s。液體石蠟，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。煤油，分析純，天津市盛鑫源偉業(yè)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

土壤樣品為大慶含蠟原油污染土壤。

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基有：

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，分析純，250 g)：去離子水1000 mL、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、pH值7.0±0.2。添加15%瓊脂，得到LB固體培養(yǎng)基。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純，500 g)：去離子水1000 mL、K2HPO41 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NH4Cl 1 g、 NaNO31 g、微量元素液10 mL。

微量元素液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純，100 g)：去離子水1000 mL、MnSO40.01 g、FeSO40.1 g、CaCl·2H2O 0.01 g、ZnSO40.01 g、CuSO4·5H2O 0.01 g、CoCl 0.01 g、H3BO40.01 g、NaMoO40.01 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜蠟菌的篩選及鑒定

將5 g石油污染土壤加入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并添加0.5 mL液體石蠟，在37 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)3 d，然后取1 mL上清液加入新鮮培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁時(shí)，再次轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接過(guò)程中液體石蠟添加量由0.5 mL逐步提升到 5 mL。如此反復(fù)轉(zhuǎn)接6次后，將100 μL上清液梯度稀釋后涂布于LB固體平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑出單菌落反復(fù)劃線純化，分離出嗜蠟菌。將菌株交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，確定該菌菌屬。

1.2.2 菌株最適生長(zhǎng)環(huán)境的優(yōu)化

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至108CFU/mL，以3%接種量接種于100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并添加2%石蠟為碳源，在不同溫度、pH值、鹽含量條件下通過(guò)紫外分光光度計(jì)(上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品)測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線。

最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定：在31、34、37、40、43 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為600 nm)測(cè)定菌液光密度值(OD)。

最適生長(zhǎng)pH值測(cè)定：用HCl與NaOH將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基pH值調(diào)為5～9，并測(cè)定OD值。

最適生長(zhǎng)NaCl含量測(cè)定：將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)為0～5%，并測(cè)定OD值。

1.2.3 代謝產(chǎn)物——生物表面活性劑的分析

將菌株以3%接種量接種于100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并添加2%石蠟為碳源，增設(shè)不加菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照，在37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。

界面張力測(cè)定：將發(fā)酵液(即加入菌株培養(yǎng)一定時(shí)間后的培養(yǎng)基)離心去除菌體，采用JJ2000B旋轉(zhuǎn)滴界面張力測(cè)量?jī)x(上海中晨數(shù)字設(shè)備有限公司產(chǎn)品)測(cè)定發(fā)酵液界面張力，并與不加菌的對(duì)照組比較。

發(fā)酵液乳化性能測(cè)定：將實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液與對(duì)照組中的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基各取4 mL分別與4 mL液體石蠟混合，采用渦旋混合器高速振蕩2 min，在室溫下靜置24 h后，測(cè)量乳化高度，并根據(jù)公式(1)計(jì)算乳化系數(shù)(E24)[9-10]。

(1)

式(1)中：h為乳化層高度，cm；H為混合液體總高度，cm。

排油圈測(cè)定：量取60 mL去離子水加入直徑為 15 cm 的潔凈無(wú)菌平皿中，并在平皿中心添加1 mL經(jīng)油紅染色的液體石蠟形成油膜，向油膜中心滴 50 μL 經(jīng)離心去除菌體的發(fā)酵液，觀察排油圈的形成情況。

表面活性劑提取及鑒定：將菌株發(fā)酵液離心去除菌體，用6 moL的HCl將上清液pH值調(diào)為2，4 ℃ 條件下靜置12 h，再離心收集沉淀，然后溶于氯仿與甲醇混合液(氯仿/甲醇體積比為2/1)中，過(guò)濾后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃條件下蒸干有機(jī)相，得到生物表面活性劑。將1 mg生物表面活性劑與100 mg KBr混合研磨、壓片，通過(guò)傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)熱電公司產(chǎn)品)在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞疏水性測(cè)定

通過(guò)高速離心機(jī)(日本HITACHI產(chǎn)品)在10000 r/min條件下將發(fā)酵液離心收集菌體，用緩沖液洗滌2次，并用緩沖液將菌體的光密度值(OD1)稀釋至0.3～0.6；再將等體積煤油與菌液混合，高速渦旋振蕩2 min，靜置1 h，同等條件下測(cè)定水相(菌液)的OD2，細(xì)胞疏水性通過(guò)公式(2)進(jìn)行計(jì)算[11]。

細(xì)胞疏水性=(1-OD2/OD1)×100%

(2)

1.2.5 菌株降解性能測(cè)定

將菌株以3%接菌量接入100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入50 mL大慶含蠟原油，在37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后，通過(guò)差示掃描量熱儀(美國(guó)TA梅特勒-利托多公司產(chǎn)品)測(cè)定含蠟原油蠟含量、析蠟點(diǎn)、析蠟高峰點(diǎn)等參數(shù)變化[12]。收集對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的含蠟原油，通過(guò)高速冷凍離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為3000 r/min條件下低速離心脫水后，測(cè)量菌株處理前后原油的質(zhì)量變化。

1.2.6 菌株對(duì)蠟晶結(jié)構(gòu)形態(tài)影響的測(cè)定

取少量低速離心脫水后的油樣均勻置于載玻片上，在37 ℃、100倍放大倍數(shù)條件下，通過(guò)BX-53偏光顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品)觀察嗜蠟菌處理后蠟晶的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.7 菌株對(duì)原油流變性影響的測(cè)定

將50 mL含蠟原油與100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，以3%接種量將嗜蠟菌接入，并設(shè)置不加菌對(duì)照組，在37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)7 d后離心脫水，在不同溫度及剪切率條件下通過(guò)HAAKE流變儀(上海珩璟科技有限公司產(chǎn)品)對(duì)油樣黏度進(jìn)行測(cè)量，并繪制黏-溫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜蠟菌的鑒定結(jié)果

16SrDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI中比對(duì)后，結(jié)果表明：嗜蠟菌樣品與假單孢菌屬同源性達(dá)到99%以上，因此可確定該嗜蠟菌為假單孢菌屬。

2.2 菌株最適生長(zhǎng)環(huán)境的優(yōu)化選擇

不同的環(huán)境因素可促進(jìn)或抑制微生物的生長(zhǎng)，而微生物清防蠟技術(shù)的關(guān)鍵就是確保微生物具有良好的活性強(qiáng)度，最大程度發(fā)揮菌種性能。通過(guò)測(cè)定菌液OD值的大小可以反映出菌株活性強(qiáng)度，OD值越大菌株活性越強(qiáng)，從而優(yōu)化出菌株最適生長(zhǎng)環(huán)境。每12 h通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液在不同條件下的OD值，并據(jù)此繪制菌株生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出：菌株活性強(qiáng)度隨溫度的變化呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng)溫度較低時(shí)，菌體內(nèi)蛋白活性低，活性強(qiáng)度較弱；而在較高溫度下，菌體內(nèi)活性蛋白功能減弱，菌株生長(zhǎng)遭到抑制。為充分發(fā)揮菌種性能，確定菌株最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。

圖1 不同溫度下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of strains at different temperatures

圖2為不同pH值條件下菌株的生長(zhǎng)曲線。從圖2可以看出：菌株在pH值為5～9范圍內(nèi)都具有較高活性強(qiáng)度；當(dāng)培養(yǎng)基pH值為7時(shí)，活性強(qiáng)度最高。這表明該菌株最適合在中性環(huán)境下生長(zhǎng)，并對(duì)弱酸或弱堿環(huán)境都具有一定適應(yīng)能力。而為保證菌株較高降解作用，確定菌株最適pH值為7.0。

圖2 不同pH值條件下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of strains with different pH values

不同鹽含量會(huì)影響細(xì)胞滲透壓，過(guò)高或過(guò)低的滲透壓均會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[13]。圖3為不同NaCl含量下菌株的生長(zhǎng)曲線。從圖3可以看出,菌株活性強(qiáng)度隨著NaCl含量增加呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，并在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)活性最強(qiáng)。因此，確定菌株最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

圖3 不同鹽含量下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of strains with different salt contentsw(Salt)/%: 0; 1; 2; 3; 4; 5

2.3 代謝產(chǎn)物——生物表面活性劑的分析結(jié)果

2.3.1 界面張力測(cè)定結(jié)果

通過(guò)界面張力測(cè)量?jī)x測(cè)得不加菌對(duì)照組溶液的界面張力為78.26 mN/m，而測(cè)得加菌發(fā)酵液(去除菌體)的界面張力為37.45 mN/m，說(shuō)明該菌株顯著降低了液體界面張力，可促進(jìn)油、水兩相混合，有利于菌株對(duì)石蠟的降解。

2.3.2 乳化性能結(jié)果

生物表面活性劑的乳化性能是微生物清、防蠟的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。乳化作用可形成水包油乳狀液，可降低摩擦阻力，還可增大細(xì)菌與石蠟的接觸面積[15]，促進(jìn)細(xì)菌降解?；旌弦红o置24 h后，發(fā)現(xiàn)不加菌對(duì)照組無(wú)乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，而菌株發(fā)酵液乳化現(xiàn)象顯著，通過(guò)測(cè)量乳化層高度，并通過(guò)公式(1)計(jì)算得到菌株乳化系數(shù)約為70%。結(jié)果表明，該嗜蠟菌具有較強(qiáng)的乳化性能，有利于提高含蠟原油的流動(dòng)性。

2.3.3 排油圈測(cè)定結(jié)果

將培養(yǎng)7 d后的發(fā)酵液離心去除菌體后進(jìn)行排油活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)油膜由中心向四周排擠，形成了一個(gè)直徑約為9.1 cm的排油圈，如圖4所示。這表明該嗜蠟菌能產(chǎn)生較高含量的生物表面活性劑。排油圈直徑的大小與生物表面活性劑的活性成正比，嗜蠟菌產(chǎn)生的生物表面活性劑，在增加蠟溶解度方面具有較好促進(jìn)作用，有利于細(xì)菌降解。

2.3.4 生物表面活性劑的提取及鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌株代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑的光譜圖如圖5所示。

從圖5可以看出：生物表面活性劑在3281.71 cm-1處出現(xiàn)了1個(gè)特征峰，是由分子間氫鍵引起的—NH鍵伸縮振動(dòng)；2920.45 cm-1和2852.12 cm-1處的特征峰是脂肪族的—CH鍵伸縮振動(dòng)；1668.42 cm-1和1542.54 cm-1處的吸收峰表明存在1個(gè)仲酰胺鍵(—CO—N)；1454.76 cm-1的吸收峰表明此處有CH3基團(tuán)做不對(duì)稱形變振動(dòng)；1062.09 cm-1的吸收峰為C—O—C對(duì)稱伸縮振動(dòng)。該生物表面活性劑在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰與脂肽的吸收峰相一致，因此確定為脂肽類物質(zhì)。結(jié)果表明，該嗜蠟菌在降解石蠟過(guò)程中可產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，與Liu、Cheng、Ismail等[16-18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖4 發(fā)酵液排油活性檢測(cè)照片F(xiàn)ig.4 Test photos of oil displacement activity offermentation broth(a) Oil film morphology of fermentation broth was added to the control group; (b) Oil film morphology of fermentation broth with drop addition

圖5 菌株代謝產(chǎn)物生物表面活性劑的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopyof strain metabolites

2.4 細(xì)胞疏水性分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得經(jīng)緩沖液稀釋菌液的光密度值OD1為0.507；將等體積的煤油與菌液混合后，測(cè)得菌液的光密度值OD2為0.397；通過(guò)公式(2)計(jì)算出細(xì)菌的細(xì)胞疏水性為21.69%。細(xì)胞疏水性與烴類物質(zhì)的降解有著密切聯(lián)系，疏水性高的細(xì)菌更易附著在疏水性底物上，加快對(duì)該物質(zhì)的降解[19]。結(jié)果表明，該菌株具有較強(qiáng)疏水性能，為石蠟降解提供了有利條件。此結(jié)果與王靖等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.5 菌株降解性能分析結(jié)果

菌株處理前后含蠟原油的蠟含量、析蠟點(diǎn)、析蠟高峰點(diǎn)測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株處理前后含蠟原油蠟含量、析蠟點(diǎn)及析蠟高峰點(diǎn)的變化Table 1 Changes of wax content, wax precipitation point andwax peak point of waxy crude oil before andafter strain treatment

從表1分析得到，含蠟原油在經(jīng)菌株作用后，其蠟含量、析蠟點(diǎn)、析蠟高峰點(diǎn)及油質(zhì)量均降低，除蠟率達(dá)到43%，析蠟點(diǎn)降低1.27 ℃，析蠟高峰點(diǎn)降低1.19 ℃，原油質(zhì)量降低3.02 g。石蠟為C16～C28之間的飽和烴。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明菌株對(duì)該區(qū)間的烴類物質(zhì)的降解較為顯著。蠟含量的降低，可大幅減少蠟沉積；而析蠟點(diǎn)及析蠟高峰點(diǎn)的降低在一定程度上還有利于減少蠟組分的析出，具有一定清、防蠟作用。

2.6 菌株對(duì)蠟晶結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

菌株處理前后含蠟原油樣品中的蠟晶結(jié)構(gòu)如圖6 所示。從圖6(a)可以看出：加菌處理前含蠟原油中的蠟晶尺寸大、成塊狀聚集、分布密集。含蠟原油經(jīng)過(guò)嗜蠟菌處理后，油中蠟晶數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)尺寸減小且分布更為稀疏，從而使蠟晶間不易形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)，一定程度上可減少蠟沉積的形成。

圖6 菌株處理前后含蠟原油中的蠟晶結(jié)構(gòu)Fig.6 Structure of wax crystal in crude oilbefore and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

2.7 菌株對(duì)原油流變性的影響

不同溫度及不同剪切率條件下測(cè)得菌株處理前后含蠟原油樣品的黏-溫曲線如圖7所示。可以看出，含蠟原油經(jīng)嗜蠟菌處理后，含蠟原油非牛頓流體黏度從488.4～5259 mPa·s下降到400.5～4294 mPa·s，黏度約下降18%，反常點(diǎn)由46 ℃降至44.5 ℃。黏度與反常點(diǎn)是判定原油流動(dòng)性好與差的重要指標(biāo)，二者數(shù)值越低越利于提高原油流動(dòng)性能。該菌株通過(guò)降解石蠟，降低了含蠟原油的黏度及反常點(diǎn)，從而有效提高了含蠟原油流動(dòng)性。

圖7 菌株處理前后含蠟原油的黏-溫曲線Fig.7 Viscosity-temperature curves of waxy crude oil before and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

3 結(jié) 論

(1)嗜蠟菌經(jīng)16SrDNA鑒定為假單孢菌屬。該菌株最適生長(zhǎng)環(huán)境為溫度37 ℃、pH值7.0、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

(2)該嗜蠟菌具有較強(qiáng)的表面活性，能產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，可將發(fā)酵液界面張力由78.26 mN/m降低至37.45 N/m，乳化系數(shù)達(dá)到70%，并具有較強(qiáng)的排油活性及良好的疏水性能。

(3)含蠟原油經(jīng)嗜蠟菌處理7 d后，油樣中蠟晶結(jié)構(gòu)尺寸減小及數(shù)量減少，可使含蠟原油析蠟點(diǎn)降低1.27 ℃、析蠟高峰點(diǎn)下降1.19 ℃、蠟含量降低43%、黏度降低18%，有效提高了含蠟原油流動(dòng)性。