秦芳 秦淑英 王新森 劉文玉 李偉偉

(1安陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，河南 安陽(yáng) 455000；2安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院放射二科；3濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院普外科；4新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤二科)

非小細(xì)胞肺癌是肺癌導(dǎo)致的相關(guān)性死亡的首要原因，手術(shù)治療、放療和化療等是其常用的治療手段，但效果均不太理想。姜黃素是一種來(lái)自姜科植物姜黃等根莖的酚性色素，因其具有毒副作用小和抗癌譜廣等優(yōu)勢(shì)一直備受腫瘤界學(xué)者們的青睞〔1～3〕。有研究〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)上調(diào)(miR-15a/16)發(fā)揮促乳腺癌凋亡和抗白血病細(xì)胞增殖的作用。已研究〔6～8〕證實(shí)，miR-15a/16在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)，并且姜黃素可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但姜黃素的抗腫瘤作用是否通過(guò)調(diào)控miR-15a/16表達(dá)來(lái)執(zhí)行尚不清楚。本研究旨在探討miR-15a/16在姜黃素抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及促凋亡過(guò)程中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，姜黃素和噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Trizol和Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，miR-15a/16模擬物及對(duì)照、miR-15a/16抑制劑及對(duì)照購(gòu)于美國(guó)RiboBio公司，雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪公司，細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤(BCL)2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Pall公司，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總蛋白提取試劑盒、TUNEL-DAPI雙染試劑盒和Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于培養(yǎng)條件為飽和濕度、5%CO2和37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待A549細(xì)胞匯合度達(dá)85%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例傳代。收集長(zhǎng)勢(shì)良好的第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將A549細(xì)胞以每孔200 μl(濃度為6×105個(gè)/ml)接種于96孔細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后，加入終濃度分別為0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理A549細(xì)胞，并標(biāo)記為對(duì)照組(0.0 μmol/L姜黃素)、姜黃素12.5 μmol/L組、姜黃素25.0 μmol/L組和姜黃素50.0 μmol/L組，每個(gè)處理組設(shè)置6個(gè)平行孔。于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后，加入40 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。棄上清后，加入200 μl的二甲基亞砜，震蕩反應(yīng)10 min。待紫色結(jié)晶充分溶解后，選取490 nm波長(zhǎng)，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞的光密度值(A)。根據(jù)細(xì)胞存活率=100%×(處理組A/對(duì)照組A)計(jì)算各處理組細(xì)胞的細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3Caspase3活性檢測(cè) 收集以0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后A549細(xì)胞，以1 000 r/min離心棄上清后，加入細(xì)胞裂解液，參照Caspase3活性檢測(cè)試劑盒操作步驟檢測(cè)各濃度姜黃素處理下A549細(xì)胞的Caspase3活性。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)miR-15a/16表達(dá) 經(jīng)0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后，收集A549細(xì)胞，以總RNA提取試劑盒獲取總RNA，并以1 μg總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以4.0 μl cDNA、各1.0 μl濃度為10 μmol/L的正反引物、1 μl ROX Reference Dye Ⅱ、25 μl 2×SYBR Premix Ex Taq和18 μl ddH2O配成50 μl反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃ 預(yù)變性 5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性 15 s、58℃ 退火30 s、72℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法檢測(cè)不同濃度姜黃素處理下A549細(xì)胞中miR-15a/16的相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物合成，各基因引物序列：miR-15a：上游：5′-GCGGTAGCAGCACATAATG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-16：上游：5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′，下游：5′-C-CAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3′；U6：上游：5′-CT-CGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以200 μl(濃度為6×105個(gè)/ml)接種至6孔細(xì)胞板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞密度達(dá)70%以上時(shí)，開始進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為對(duì)照組(未處理)、姜黃素組(給予50 μmol/L姜黃素)、anti-NC+姜黃素組(轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對(duì)照后，給予姜黃素處理)、anti-miR-15a+姜黃素組(轉(zhuǎn)染miR-15a抑制劑后給予姜黃素處理)；anti-miR-16+姜黃素組(轉(zhuǎn)染miR-16抑制劑后給予姜黃素處理)。根據(jù)Lipofectamine2000說(shuō)明書步驟將抑制劑陰性對(duì)照、miR-15a抑制劑和miR-16抑制劑分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。待轉(zhuǎn)染24 h后，加入濃度為50 μmol/L姜黃素處理48 h。并設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)染也未經(jīng)姜黃素處理的對(duì)照組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染只給予50 μmol/L姜黃素處理的姜黃素組。采用RT-PCR檢測(cè)各處理組中miR-15a和miR-16的相對(duì)表達(dá)量。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的活力。具體步驟參照1.2.4和1.2.2。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集上述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-15a抑制劑、miR-16抑制劑和陰性對(duì)照并給予姜黃素處理的各組細(xì)胞及對(duì)照組和姜黃素組的細(xì)胞，以磷酸緩沖液洗滌后，1 000 r/min離心棄上清。加入預(yù)冷的乙醇(濃度為70%)于4℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。離心后，以胰蛋白酶消化，加碘化丙啶染色后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7TUNEL-DAPI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以適當(dāng)密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種6孔細(xì)胞板(放有無(wú)菌蓋玻片)，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，按照1.2.5中的方法轉(zhuǎn)染和給予姜黃素處理后，離心棄培養(yǎng)液，在20℃條件下以濃度為4%甲醛對(duì)各處理組細(xì)胞進(jìn)行固定。固定結(jié)束后，用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞。參照TUNEL-DAPI雙染試劑盒說(shuō)明書步驟，加入TUNEL反應(yīng)液，并以3%H2O2充分固定。磷酸緩沖液洗滌后，加入0.1% TritonX-100于4℃下充分反應(yīng)。再次洗滌后，于37℃下避光加入TUNEL反應(yīng)液作用1 h后，加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色。采用熒光顯微鏡檢測(cè)400倍視野下細(xì)胞的凋亡情況，并拍照。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-15a/16靶基因 Targetscan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-15a和miR-16均與CyclinD1和BCL2 的3′-非編碼區(qū)(UTR)存在結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證miR-15a和miR-16與CyclinD1和BCL2是否存在靶向關(guān)系，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至24孔板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，miR-15a模擬物(miR-16模擬物)+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，anti-NC+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，anti-miR-15a(anti-miR-16)+CyclinD1野生型(BCL2野生型)。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書步驟分別轉(zhuǎn)染CyclinD1野生型(BCL2野生型)報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-15a模擬物(miR-16模擬物)或miR-15a抑制劑(miR-16抑制劑)、模擬物陰性對(duì)照或抑制劑陰性對(duì)照進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中雙熒光素酶的活性。其中，將陰性對(duì)照組的熒光素酶活性設(shè)為1，并以海腎熒光素酶活性作內(nèi)參對(duì)目的基因的熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)化。

1.2.9Western印跡檢測(cè)CyclinD1和BCL2蛋白表達(dá) A549細(xì)胞處理后，參照總蛋白提取試劑盒提取各處理組細(xì)胞中的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白的濃度。取蛋白樣品80 μg，加入等體積上樣緩沖液，于沸水浴中變性3～5 min。上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)PVDF膜結(jié)束后，放入含5%的脫脂牛奶的封閉液中處理2 h。CyclinD1一抗的稀釋比例為1∶800，BCL2和GAPDH一抗的稀釋比例均為1∶1 000。 4℃下，將封閉后的PVDF膜與一抗反應(yīng)24 h后，于37℃下加入1∶2 000倍稀釋的二抗，震蕩反應(yīng)2 h后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素抑制A549細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡 以0.0、12.5、25.0和50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞的存活率依次降低，姜黃素能夠呈濃度依賴地抑制A549細(xì)胞增殖(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)Caspase3活性發(fā)現(xiàn)，12.5、25.0和50.0 μmol/L姜黃素作用后，A549細(xì)胞的Caspase3活性較對(duì)照組均明顯升高，姜黃素能夠呈濃度依賴地誘導(dǎo)A549細(xì)胞中Caspase3活性增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞活力和Caspase3活性的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，表2同

2.2姜黃素呈濃度依賴地誘導(dǎo)A549細(xì)胞中miR-15a/16的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)0、12.5、25和50 μM姜黃素處理48 h后A549細(xì)胞中miR-15a/16的相對(duì)表達(dá)量依次升高。與對(duì)照組相比，miR-15a/miR-16的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)出一定的姜黃素濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中miR-15a/16表達(dá)的影響

2.3下調(diào)miR-15a/16可逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制 姜黃素處理后A549細(xì)胞中miR-15a和miR-16的表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照未能改變姜黃素誘導(dǎo)的miR-15a和miR-16的表達(dá)(P>0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16抑制劑后，姜黃素誘導(dǎo)的miR-15a和miR-16的表達(dá)均明顯受到抑制(P<0.05)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后A549細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯減弱(P<0.05)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照對(duì)姜黃素處理下A549細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16抑制劑后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，姜黃素能夠使A549細(xì)胞在G1期所占比例明顯升高(P<0.05)，而S期所占比例明顯降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照不影響上述姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的作用(P>0.05)，而miR-15a和miR-16抑制劑能夠明顯逆轉(zhuǎn)姜黃素引起的G1期比例明顯降低、S期比例明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 下調(diào)miR-15a/16對(duì)姜黃素作用下A549細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與anti-NC+姜黃素組比較：2)P<0.05

2.4下調(diào)miR-15a/16可逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 TUNEL-DAPI雙染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例與姜黃素處理組無(wú)明顯差異(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16抑制劑后，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例較姜黃素處理組明顯降低(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)各處理組中Caspase3相對(duì)活性發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后A549細(xì)胞中Caspase3活性較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照未能改變姜黃素對(duì)Caspase3活性的影響(P>0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-15a和miR-16抑制劑后，姜黃素誘導(dǎo)的Caspase3活性明顯受到抑制(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 下調(diào)miR-15a/16對(duì)姜黃素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響(×200)

表4 下調(diào)miR-15a/16對(duì)姜黃素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與anti-NC+姜黃素組比較：2)P<0.05

2.5CyclinD1和BCL2是miR-15a/16的靶標(biāo) 利用Targetscan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CyclinD1和BCL2的3′-UTR中含有與miR-15a/16互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖2A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性與相應(yīng)的陰性對(duì)照相比均明顯降低(P<0.05)；同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-16模擬物后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性也明顯降低(P<0.05)。反之，轉(zhuǎn)染miR-15a抑制劑后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-16抑制劑后，與轉(zhuǎn)染miR-15a抑制劑的結(jié)果相一致，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性均顯著升高(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)CyclinD1和BCL2蛋白表達(dá)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物能夠顯著下調(diào)CyclinD1和BCL2蛋白表達(dá)(P<0.05)；反之則上調(diào)CyclinD1和BCL2表達(dá)(P<0.05)；同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-16模擬物后CyclinD1和BCL2蛋白的表達(dá)也顯著下降，反之則明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2B和表5、6。

1～6：陰性對(duì)照組、miR-15a組、miR-16組、anti-NC組、anti-miR-15a組、anti-miR-16組圖2 miR-15a/16與靶基因CyclinD1和BCL2的結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)靶基因蛋白表達(dá)的影響

組別CyclinD1BCL2陰性對(duì)照組1.00±0.081.00±0.11miR-15a組0.36±0.041)0.38±0.041)miR-16組0.41±0.041)0.42±0.041)anti-NC組1.06±0.090.98±0.10anti-miR-15a組2.15±0.222)1.98±0.192)anti-miR-16組 2.32±0.242)2.01±0.212)F/P值103.155/0.00088.819/0.000

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；與anti-NC組比較：2)P<0.05；下表同

表6 miR-15a/16對(duì)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肺癌是導(dǎo)致人類癌癥死亡的重要原因，而非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的85%。miRNAs是一類在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)等中發(fā)揮重要作用的非編碼RNA，大量研究〔9～11〕證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展與miRNAs的異常表達(dá)及調(diào)控關(guān)系密切。miR-15a和miR-16作為miRNAs中的重要成員，在卵巢癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病和前列腺癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常低表達(dá)，是腫瘤診斷和治療的分子標(biāo)記物和靶基因〔12～14〕。在多發(fā)性骨髓瘤中，下調(diào)miR-15a/16可通過(guò)增強(qiáng)CABIN1表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖〔15〕；而上調(diào)miR-15a/16表達(dá)可促進(jìn)人骨肉瘤SOSP-9607細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖〔16〕。另外，miR-15a/16的過(guò)度表除了抑制了人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變外，還能夠顯著增強(qiáng)了抗癌藥物喜樹堿誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞自噬和凋亡〔17〕。此外，具有抗腫瘤作用的白藜蘆醇和野黃芩苷等均能夠通過(guò)上調(diào)miR-15a/16的表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用〔18，19〕。姜黃素是一種研究較多的抗腫瘤藥物，其對(duì)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展具有較好的抑制作用，但其抗非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制并不完全清楚〔20〕。有報(bào)道〔4，5〕顯示，姜黃素可通過(guò)上調(diào)miR-15a和miR-16表達(dá)促進(jìn)乳腺癌凋亡和抑制白血病細(xì)胞增殖，但其抗非小細(xì)胞肺癌是否通過(guò)上調(diào)miR-15a/16表達(dá)來(lái)執(zhí)行并不清楚。本研究結(jié)果表明，CyclinD1和BCL2是miR-15a/16的靶基因。這一結(jié)果與Cai等〔21〕和Zhang等〔22〕報(bào)道的miR-15a/16通過(guò)直接結(jié)合CyclinD1 和BCL2 3′-UTR抑制CCND1和BCL2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的結(jié)果相吻合。綜上，姜黃素是一種很有潛力的抗非小細(xì)胞肺癌的藥物，其通過(guò)上調(diào)miR-15a/16表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的活性可能是其重要的途徑之一，miR-15a/16有望成為非小細(xì)胞肺癌治療的重要靶基因。