錢蘭華 錢瑋 沈雪林 胡翠英 劉乾 蔣晨威 朱昫飏 王桃云

摘要：為獲得耐鹽促生菌株并明確其促生特性，通過耐鹽試驗(yàn)和ACC脫氨酶活性對(duì)沿海灘涂鹽堿地土壤中的微生物進(jìn)行分離篩選，得到5株耐鹽菌株，其中B7的耐鹽活性最強(qiáng)。接著采用平皿法和盆栽法研究了鹽脅迫下黃瓜種子發(fā)芽及盆栽試驗(yàn)中B7對(duì)黃瓜的耐鹽促生作用。同時(shí)對(duì)B7的多種促生能力進(jìn)行測(cè)定，最后通過菌株形態(tài)、生理生化特征測(cè)定及其16S rDNA序列鑒定出B7菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。研究結(jié)果表明，該菌株能明顯提高黃瓜耐鹽促生能力，同時(shí)具有產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)氨、固氮及解磷等多種促生能力，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：耐鹽;分離篩選;鑒定;巨大芽孢桿菌;黃瓜;促生作用

中圖分類號(hào)： S154. 39文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0160-04

收稿日期：2018-05-31

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目-應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：SYN201525）。

作者簡介：錢蘭華（1976—），女，江蘇興化人，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治研究。E-mail：lanhuaqian@126.com。

通信作者：王桃云，博士，副教授，主要從事植物、微生物資源研究。E-mail：wangtaoyun@usts.edu.cn。

土壤鹽漬化是一個(gè)全球性的農(nóng)業(yè)問題，是當(dāng)前威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子，目前全球有50%的灌溉土地受到不同程度的鹽害[1]。中國鹽漬土壤的分布范圍廣、類型多，總面積約1億hm2，而且鹽堿地面積正逐年增加[2]。如何改良和利用大面積鹽漬化土地，以及保護(hù)并提高重要的經(jīng)濟(jì)作物抵抗鹽脅迫的能力是當(dāng)前國際社會(huì)亟待解決的重要農(nóng)業(yè)科技問題。目前，主要生物改良方法是培育并種植耐鹽堿作物，如種植檉柳、水稻、向日葵以及耐鹽植物田菁、紫穗槐等，此外還有耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究，但該類方法往往周期長、花費(fèi)大，同時(shí)，植物轉(zhuǎn)基因方法還未被社會(huì)廣泛接受和認(rèn)可[3]。

根際微生物是指在植物根系土壤范圍內(nèi)生長繁殖細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物。大多數(shù)根際微生物對(duì)植物無害且對(duì)植物生長有促進(jìn)作用。這些根際微生物具有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物生長激素、鐵載體以及誘導(dǎo)植物抗性的功能。利用根際微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生能力的方法具有投資少、見效快、效益高等特點(diǎn)。因此有關(guān)根際微生物耐鹽促生的功能活性研究已經(jīng)受到相關(guān)研究者的廣泛關(guān)注[4]。

本研究擬對(duì)沿海灘涂植物根系周圍土壤中耐鹽微生物進(jìn)行篩選，并對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)耐鹽菌株耐鹽特性、多種促生能力及其對(duì)鹽脅迫下黃瓜種子發(fā)芽及盆栽試驗(yàn)中的耐鹽促生作用進(jìn)行研究。最后通過菌株形態(tài)、生理生化特征測(cè)定及其16S rDNA序列初步鑒定出耐鹽優(yōu)勢(shì)菌株的種屬，以期為提高農(nóng)作物抗鹽能力提供新策略。

1?材料與方法

1.1?樣品采集

土樣采自江蘇省南通市啟東呂四鎮(zhèn)的海邊灘涂，土壤采樣深度為5～20 cm，采回的土壤經(jīng)風(fēng)干、粉碎后過100目篩待用。

1.2?主要儀器

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），上海新苗醫(yī)療器械公司;高速冷凍離心機(jī)（Fresco 17），美國Thermo公司;高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FB），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;數(shù)顯pH計(jì)（PHS-3TC），上海天達(dá)儀器有限公司;紫外可見分光光度儀（UV-2450），日本島津公司;恒溫?fù)u床（TS-2102），上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;光學(xué)顯微鏡（CX21），日本奧林巴斯公司。

1.3?主要試劑與培養(yǎng)基

2-羥基丁二酸，2-甲基-3-羥基-4，5-二羥甲基吡啶鹽酸鹽，哌嗪-1，4-二乙磺酸，吲哚-3-乙酸，三氧化鉬，乙二胺四乙酸鐵鈉等購于上海阿拉丁生化科技有限公司;胰蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉，氯化鈉，α-氨基吲哚基丙酸，維生素H，考馬斯亮藍(lán)，奈斯勒試劑和鉬酸鈉等購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基，無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基，CAS檢測(cè)平板，AF培養(yǎng)基，DF培養(yǎng)基和ADF培養(yǎng)基，無色氨酸King培養(yǎng)基，WA培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基等[5-7]。

1.4?耐鹽菌株的分離篩選

1.4.1?土壤菌株分離純化?取處理好的土樣1 g懸浮于裝有100 mL無菌水的250 mL三角錐形瓶中，在30 ℃、180 r/min 搖床中振蕩30 min，靜置10 min，得到土壤懸浮液。然后將此懸浮液稀釋為原始濃度的10-1～10-5倍，涂布于LB培養(yǎng)基平板上，于30 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取各種不同類型的單菌落，經(jīng)過多次平板純化后，接種于LB斜面并在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2?菌株耐鹽能力測(cè)定[8]?利用含一定NaCl濃度的NA培養(yǎng)基篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于鹽濃度為6%的培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，以相同條件下各平板中菌落數(shù)量多少來篩選耐鹽優(yōu)勢(shì)菌株。

1.4.3?耐鹽菌株ACC脫氨酶活性測(cè)定

通過制作α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定α-丁酮酸含量：按照趙龍飛等所述方法[9]，測(cè)定菌株粗酶液在540 nm波長下的吸光度，并以α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，以吸光度（D540 nm）為縱坐標(biāo)，繪制α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算粗酶液中的α-丁酮酸含量。

ACC脫氨酶比活力測(cè)定：參照Bradford的方法[10]比色測(cè)定細(xì)胞提取液中總蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考Saleh等的方法[11]，以反應(yīng)體系中每毫克菌體蛋白酶每小時(shí)催化ACC脫氨生成α-丁酮酸的微摩爾量表示ACC脫氨酶活性，其單位為μmol/（mg·h），設(shè)置空白對(duì)照。測(cè)定結(jié)果為3次重復(fù)值。

1.5?優(yōu)勢(shì)耐鹽菌株B7的各種促生能力測(cè)試

1.5.1?B7固氮能力的測(cè)定[12]

活化細(xì)菌，挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18 h，分別吸取10 μL菌液到固氮培養(yǎng)基（NFb）平板上，菌株能在NFb中生長，且能使培養(yǎng)基變藍(lán)者視為有固氮活性，記錄為“+”，不變色記錄為“-”。

1.5.2?B7菌株解磷能力測(cè)定

參照Ribeiro等所述方法[13-14]，活化B7菌株，挑取單菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)18 h，分別吸取10 μL菌液到有機(jī)磷培養(yǎng)基（OPA）和無機(jī)磷培養(yǎng)基（NPA）平板上，28～30 ℃培養(yǎng)96 h。觀察方法：NPA平板上有無透明圈，有透明圈者記錄為“+”，無透明圈者記錄為“-”;OPA平板上有渾濁斑記為“+”，無渾濁斑則記錄為“-”;

1.5.3?B7菌株產(chǎn)嗜鐵素活性的檢測(cè)

通過CAS檢測(cè)平板法進(jìn)行細(xì)菌產(chǎn)嗜鐵素活性檢測(cè)[15]。根據(jù)檢測(cè)平板中是否產(chǎn)生橘黃色暈圈來判斷菌株是否能產(chǎn)生嗜鐵素。觀察方法：CAS平板上有橘黃色暈圈者記錄為“+”，無橘黃色暈圈者記錄為“-”。

1.5.4?B7菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定

參照Wichner等的方法[16-17]，將分離純化后的菌株接種于具有L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，加入等量Salkowski顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，同時(shí)以加入等量IAA標(biāo)準(zhǔn)液作為陽性對(duì)照，在室溫、避光條件下放置顯色0.5 h，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)生IAA。

1.5.5?B7菌株產(chǎn)氨能力測(cè)定

產(chǎn)氨能力的測(cè)定參照康貽軍等的方法[5]。將菌株轉(zhuǎn)接到含10 mL蛋白胨水（10 g/L）試管中，28 ℃培養(yǎng)48 h，每管加入0.5 mL Nesslers試劑，顏色由褐色轉(zhuǎn)為黃色的表明有氨產(chǎn)生。試管中溶液由褐色轉(zhuǎn)為黃色者記錄為“+”，試管中溶液不變色者記錄為“-”。

1.5.6?菌株賦值評(píng)估

根據(jù)以上促生能力測(cè)試結(jié)果，對(duì)耐鹽優(yōu)勢(shì)菌B7的促生潛力進(jìn)行賦值評(píng)估，具有某種促生能力時(shí)賦1分，沒有該促生能力時(shí)賦0分。

1.5.7?B7菌株酸產(chǎn)堿能力測(cè)定

取B7菌懸液200 μL加到NFM培養(yǎng)基（50 mL）中，在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。觀察顏色，若培養(yǎng)液變成黃色則說明此菌株是產(chǎn)酸菌株;若變成藍(lán)色則說明此菌株是產(chǎn)堿菌株。

1.6?耐鹽生長曲線的測(cè)定

配制不同氯化鈉濃度（2%、4%、6%、8%、10%）的LB液體培養(yǎng)基，將B7接種至不同鹽濃度的培養(yǎng)基中，在搖床上以180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后取出，在600 nm波長下測(cè)定其吸光度，以鹽濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，制作耐鹽生長曲線。

1.7?菌株理化性質(zhì)檢測(cè)

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）[19]進(jìn)行耐鹽優(yōu)勢(shì)菌株B7的形態(tài)和生理生化鑒定。

1.8?菌株B7分子學(xué)鑒定

將菌株用LB液體培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，離心收集菌體，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，提取總基因組DNA，采用通用引物27F/1492R（正向引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增。產(chǎn)物測(cè)序后，將測(cè)序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以確定菌株的分類。

1.9?菌株B7對(duì)黃瓜發(fā)芽的促生試驗(yàn)

取黃瓜種子適量放入燒杯中進(jìn)行消毒滅菌，然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h，備用。準(zhǔn)備適量的培養(yǎng)皿，將脫脂棉平鋪在培養(yǎng)皿底層，蓋好后滅菌待用;配置不同鹽濃度的氯化鈉溶液，滅菌后倒入培養(yǎng)皿中并沒過脫脂棉，做好標(biāo)記;將已經(jīng)浸泡過菌液的黃瓜種子放入不同鹽濃度的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放40個(gè)種子（以加蒸餾水的培養(yǎng)皿作為空白對(duì)照），放入光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d（前3 d暗培養(yǎng)，后4 d12 h光照培養(yǎng)，12 h暗培養(yǎng)）;試驗(yàn)結(jié)束后記錄黃瓜種子發(fā)芽率、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（每組3個(gè)重復(fù)）。

1.10?菌株B7對(duì)盆栽黃瓜的促生試驗(yàn)

取黃瓜種子適量放入燒杯中進(jìn)行消毒滅菌，然后用無菌水清洗3次;把上述已清洗好的黃瓜種子放入耐鹽菌株B7菌液中浸泡6 h，備用。采用營養(yǎng)土與蛭石（體積比4 ∶1）混合得到盆栽基質(zhì)，然后在121 ℃滅菌1 h，冷卻后裝至穴盆中（長10 cm×寬10 cm×高10 cm），每盆裝入200 g。分別設(shè)置空白對(duì)照組（無鹽脅迫）、鹽脅迫組和鹽脅迫加菌組，每組做5個(gè)重復(fù)。每盆種入處理好的黃瓜種子3粒（鹽加菌組的種子先用菌株B7菌液浸泡6 h，空白組和鹽脅迫組用滅菌水浸泡6 h），接著用不同溶液澆灌（空白組用無菌水澆灌，鹽加菌組用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液澆灌，鹽脅迫組用200 mmol/L NaCl溶液澆灌），每周澆灌處理1次，其余時(shí)間都澆灌無菌水，出苗后，算出發(fā)芽率和出苗率，然后每盆保留1株幼苗，1個(gè)月后測(cè)定總根長、總投影面積、總根表面積、平均根系直徑和根尖數(shù)等生長指標(biāo)及可溶性糖、賴氨酸含量等生理指標(biāo)。

1.11?數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010作圖，SPASS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?耐鹽細(xì)菌的分離篩選

采用平板稀釋法共分離出27株菌株，經(jīng)過耐鹽試驗(yàn)的定性篩選，共有5株耐鹽菌株。耐鹽菌株命名分別為B1、B3、B5、B6和B7，其余22個(gè)菌株都沒有在6%鹽濃度的平板上長出來。5個(gè)菌株耐鹽試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，B7菌株的耐鹽活性最強(qiáng)。同時(shí)，菌株ACC脫氨酶活性試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，菌株B7的ACC脫氨酶活性最強(qiáng)，達(dá)到0.852 U/（mg·h）。由耐鹽試驗(yàn)和各菌株ACC脫氨酶活性試驗(yàn)結(jié)果可知，B7菌株的耐鹽能力和ACC脫氨酶活性都優(yōu)于其他幾個(gè)耐鹽菌株，因此選擇B7菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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