趙蘭蘭，宋婷婷，莫利云，熊永愛(ài)

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

放化療后骨髓抑制的發(fā)生率高達(dá)80%，患者表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板的減少，引起貧血、出血、免疫力低下等癥狀。白細(xì)胞減少最為顯著，其次是血小板減少，紅細(xì)胞減少相對(duì)不明顯，由于免疫力低下，嚴(yán)重的骨髓抑制常導(dǎo)致嚴(yán)重感染，被迫停藥或被動(dòng)減少藥量，導(dǎo)致化療無(wú)法完成，并影響患者的生活質(zhì)量，因此，骨髓抑制的治療對(duì)癌癥 化療成功及其重要。骨髓抑制是腫瘤放、化療對(duì)血液系統(tǒng)的毒性反應(yīng)之一，是限制放、化療廣泛應(yīng)用和療效發(fā)揮的重要因素。造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell,HSC)對(duì)化療及其敏感，化療藥物可嚴(yán)重破壞HSC的自我更新和細(xì)胞分化能力，這是骨髓抑制的病理機(jī)制[1]。因此，在化療過(guò)程中，保護(hù)骨髓造血功能、提升外周白細(xì)胞數(shù)，對(duì)于腫瘤的治療具有重要的意義。

現(xiàn)代臨床應(yīng)用表明，地榆具有治療腫瘤患者因放化療引起的白細(xì)胞減少癥的功效，服用劑量小，成人日服最大劑量折算為生藥材僅為60 mg。賈亮亮等[2]對(duì)地榆進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)地榆升白片對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓抑制具有良好的對(duì)抗作用，表現(xiàn)在提升外周血白細(xì)胞和骨髓DNA含量。楊金輝等[3]研究發(fā)現(xiàn)，地榆中地榆鞣質(zhì)高、中、低劑量組均能顯著升高白細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，結(jié)果表明地榆鞣質(zhì)具有顯著的升高白細(xì)胞作用。

代謝組學(xué)近年來(lái)發(fā)展迅速。英國(guó)帝國(guó)理工大學(xué)教授Jeremy Nicholson對(duì)代謝組學(xué)的定義被普遍接受：由病理生理刺激引起的生物體或物質(zhì)代謝變化的遺傳變化進(jìn)行定量測(cè)定[4]，主要通過(guò)高通量，高靈敏度和高現(xiàn)代分析技術(shù)的精確性，如核磁共振(NMR)，LC / MS和GC-MS[5]，對(duì)各種生物樣品中的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)代分析技術(shù)準(zhǔn)確、定性地分析其代謝產(chǎn)物，量化并結(jié)合有效的模式識(shí)別方法(主成分分析等監(jiān)督和識(shí)別模型;非監(jiān)督識(shí)別模型，如偏最小二乘判別分析(pcra)和樣本間差異分析，識(shí)別重要的差異代謝物，然后將代謝物信息與生物知識(shí)相關(guān)聯(lián)，如病理過(guò)程中的生化反應(yīng)和調(diào)節(jié)因子。從系統(tǒng)的角度來(lái)理解有機(jī)體生命活動(dòng)的整個(gè)代謝過(guò)程[6]。

因此本研究以地榆鞣質(zhì)為研究對(duì)象，采用以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓抑制為模型，通過(guò)代謝組學(xué)分析給藥后整體代謝輪廓，尋找潛在生物標(biāo)志物，分析代謝通路，探討地榆鞣質(zhì)升高白細(xì)胞及保護(hù)骨髓造血干細(xì)胞的機(jī)制，為地榆鞣質(zhì)的臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品和試劑 地榆鞣質(zhì)(實(shí)驗(yàn)室自制)；環(huán)磷酰胺(CTX)：批號(hào)H43020857，江蘇盛迪藥業(yè)有限公司；甲酸銨：CAS 560-69-2≥99.9%品牌Sigma；甲酸銨：批號(hào)560-69-2，純度≥99.9%，Sigma公司；甲酸：批號(hào)64-18-6，純度LC-MS grade，Merck公司；ddH2O：7732-18-5，mini公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供的體重為17～24 g的SPF級(jí)KM小鼠30只，實(shí)驗(yàn)小鼠使用許可證號(hào)SCKX(湘)2018-0021。飼養(yǎng)條件：遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室，室內(nèi)光照、濕度、溫度適宜(空調(diào)控制)，通風(fēng)條件良好，環(huán)境相對(duì)安靜，每日光照12 h。

1.3 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)TGL20M，凱達(dá)；混勻儀：型號(hào)WH-866，上海佐研；純水儀：型號(hào)H20-MM-T，Sartorius；濾膜：型號(hào)0.22 μm PTFE，津騰；液相色譜儀：型號(hào)UltiMate 3000，Thermo；質(zhì)譜儀：型號(hào)QExactivee Focuss，Thermo；數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型超聲波清洗機(jī)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 KM小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為：正常組、模型組、地榆鞣質(zhì)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)第1天，地榆鞣質(zhì)組按10 mg/kg劑量灌胃給予地榆鞣質(zhì)水溶液，連續(xù)5 d。

2.2 模型制備及血液采集 實(shí)驗(yàn)第1天，除正常組外，其余各組小鼠按100 mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液，正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第6天，各組小鼠眼眶取血，用無(wú)抗凝劑的1.5 mL EP管收集，采用全自動(dòng)血球分析儀，檢測(cè)血液中白細(xì)胞的數(shù)量。另取部分血液，以3 000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃待測(cè)。

2.3 代謝組學(xué)的血清樣品制備 在4 ℃下融化待測(cè)樣本，取200 μL于1.5 mL的離心管中，加甲醇0.8 mL于震蕩儀上振蕩1 min；于低溫離心機(jī)內(nèi)以12 000 rpm離心10 min，取上清液，移入1.5 mL離心管，減壓干燥；0.3 mL 的80%甲醇溶液復(fù)溶，0.22 μm膜過(guò)濾上清液得到待測(cè)樣本；從每個(gè)待測(cè)樣本中各取20 μL混合成QC樣本；用剩余待測(cè)樣本進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。

2.4 代謝組學(xué)的色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：T3 1.8 μm(2.1×150 mm)色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度設(shè)置8 ℃，流速為0.25 mL/min，柱溫設(shè)為40 ℃，進(jìn)樣2 μL梯度洗脫，流動(dòng)相為正離子0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；負(fù)離子5 mM甲酸銨水(C)-乙腈(D)。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，2%B/D；1～9 min，2%～50%B/D；9～12 min，50%～98%B/D；12～13.5 min，98%B/D；13.5～14 min，98%～2%B/D；14～17 min，2%B/D。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓3.80 kV，負(fù)離子噴霧電壓2.50 kV，鞘氣45 arb，輔助氣15 arb。毛細(xì)管溫度為325 ℃，以分辨率70 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍81～1 000，采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除無(wú)必要的MS/MS信息。

2.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析 Proteowizard軟件(v3.0.8789)用于將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式(XCMS輸入文件格式)。使用R(v3.3.2)XCMS包用于峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊，主要參數(shù)bw=5，ppm=15，峰寬= c(10,20)，mzwid = 0.015，mzdiff = 0.01，method= centWave。獲得包括質(zhì)荷比(m / z)，保留時(shí)間(rt)和峰面積(強(qiáng)度)的數(shù)據(jù)矩陣。在正離子模式中，獲得13 336個(gè)前體分子，而在負(fù)離子模式中，獲得6642個(gè)前體分子。獲得的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。為了使不同數(shù)量級(jí)的數(shù)據(jù)具有可比性，進(jìn)行峰面積的批量歸一化。為了找到生物標(biāo)志物，QC樣品中潛在特征峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，即變異系數(shù)不能超過(guò)30%。如果是，則應(yīng)刪除相關(guān)的特征峰。因此，在質(zhì)量控制(QC)的基礎(chǔ)上，通常進(jìn)行質(zhì)量保證(QA)以刪除QC樣品中重復(fù)性差的特征峰，從而獲得更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集并促進(jìn)生物標(biāo)記物的檢測(cè)。多元統(tǒng)計(jì)分析(R語(yǔ)言ropls包)方法，并使用主成分分析(PCA)和正交-偏最小二乘判別分析(opls-da)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行自適應(yīng)(uv)轉(zhuǎn)換和多變量統(tǒng)計(jì)分析，以獲得更可靠的直觀的結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 白細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 從圖中可以看出，與正常組相比，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，地榆鞣質(zhì)組小鼠白細(xì)胞顯著升高(P<0.05)。結(jié)果顯示，地榆鞣質(zhì)可顯著抵抗環(huán)磷酰胺所致小鼠白細(xì)胞數(shù)量減少(見(jiàn)圖1)。

*：P<0.05。圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量

3.2 血清代謝組學(xué)分析 采用LC-MS系統(tǒng)在正離子模式和負(fù)離子檢測(cè)下分析各組小鼠血清，組分連續(xù)通過(guò)色譜柱分離并流入質(zhì)譜，質(zhì)譜重復(fù)掃描數(shù)據(jù)采集，每次掃描得到一個(gè)質(zhì)譜圖，選擇強(qiáng)度最大的離子質(zhì)譜圖連續(xù)描繪，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到基峰典型色譜圖(BPC)(見(jiàn)圖2、圖3)。 在正離子和負(fù)離子模式下，不同實(shí)驗(yàn)組的峰值類型和峰值數(shù)量存在一定差異，表明各組大鼠的代謝受到顯著干擾。

圖2 負(fù)離子典型的基峰色譜圖

圖3 正離子典型的基峰色譜圖

通過(guò)主成分分析(PCA)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，去除重復(fù)性差的樣本和異常樣本，模型的交叉驗(yàn)證主要參考R2X等參數(shù)，R2X是模型的可解釋度。通常情況下，R2高于0.5較好(見(jiàn)表1)可知。從PCA得分圖(見(jiàn)圖4A、B)可觀察樣品的聚集、離散程度。樣品分點(diǎn)越靠近，說(shuō)明這些樣品中所含有的變量的組成和濃度越接近。隨之進(jìn)行OPLS-DA分析以突出區(qū)別，OPLS-DA使用正交信號(hào)校正技術(shù)，將X矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，然后過(guò)濾掉與分類無(wú)關(guān)的信息，相關(guān)的信息主要集中在第一個(gè)預(yù)測(cè)成分。用R2X、R2Y、Q2和OPLS-DA得分圖(見(jiàn)圖4C、D)來(lái)評(píng)價(jià)模型的分類效果(見(jiàn)表1)。通常，根據(jù)VIP(Variable importance for the projection)值來(lái)說(shuō)明變量(特征峰)能解釋X數(shù)據(jù)集和關(guān)聯(lián)Y數(shù)據(jù)集的重要性。所有VIP值的平方之和與模型中的變量總數(shù)相等，因此，其平均值為1揭示其顯著區(qū)分度，揭示組間存在代謝差異，DYRZ預(yù)后，代謝譜出現(xiàn)了回歸的趨勢(shì)。使用置換檢驗(yàn)圖(Permutations plot)來(lái)幫助有效評(píng)估當(dāng)前OPLS-DA模型是否過(guò)擬合(見(jiàn)圖4E、F)，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：所有藍(lán)色的Q2點(diǎn)從左到均低于最右的原始的藍(lán)色的Q2點(diǎn)；結(jié)果顯示模型相對(duì)可靠。

A、B：正離子和負(fù)離子PCA評(píng)分；C、D：OPLS-DA正離子和負(fù)離子評(píng)分；E：正常組和模型組置換檢驗(yàn)；F：模型組和地榆鞣質(zhì)置換檢驗(yàn)。圖4 正常組和模型組評(píng)分

表1PCA模型驗(yàn)證參數(shù)和OPLS-DA模型驗(yàn)證參數(shù)

PCApreR2x(cum)XM VS XK正離子模式30.559負(fù)離子模式30.615OPLS-DApreR2x(cum)R2Y(cum)Q2(cum)XM VS XK正離子模式1+1+00.4960.9990.443負(fù)離子模式1+2+00.3320.9940.57

XM-模型組；XK-正常組；XR：鞣質(zhì)組。

3.3 差異代謝物的篩選和鑒定 結(jié)合excel等分析軟件，篩選出VIP>1.0,fold-change≥1.5或≤0.667和p-value≤0.05三者的交集，從模型組和正常組共篩選出35個(gè)差異代謝物(見(jiàn)表2)，然后采用同樣的方法比較模型組和地榆鞣質(zhì)組共篩選出25種差異代謝物(見(jiàn)表3)，兩者取交集，得到阿糖胞苷、D-葡糖糖-6磷酸、α-酮異戊酸、十二烷二酸4種差異變量(見(jiàn)表4)。

表2正常組模型組小鼠血清中內(nèi)源性差異代謝物(n=10)

代謝物XM vs XK_VIP平均值-XM標(biāo)準(zhǔn)差-XM平均值-XK標(biāo)準(zhǔn)差-XK倍性變化倍性變化的log2PADMA2.393925935197436475.419372323.88248931692.315907604.551.26080.334360.0017701642-Methylguanosine2.2675754455383721.57573232.09668008883.6181408818.2571.48760.5730.0048130494-Hydroxybenzaldehyde2.17997045669011437.5218055843.4898745651.556356938.1431.43090.516880.0084012Cytarabine2.15880958?39554859.937093070.68458180428.9210028434.271.470?0.556680.00949147?Choline2.0687468081835288010138730551.7206120273288113762.821.12310.167480.015261335Cytosine2.05658775355390858.077794734.76775239398.1212374570.361.35830.441840.016192439epsilon-(gamma-Glutamyl)-lysine2.04793561518387021.745830530.40446970862.7920436805.442.55461.35310.016878579PGB32.0382457085087120.4223049186.371017704.157206922.75240.20006-2.32150.017670712Sphinganine1.90582758487439299.4920709550.9754315325.1819430618.920.62118-0.686920.0312169L-Tyrosine1.898814812817393639498691233.239869747328777743641.41510.500930.032086333epsilon-Caprolactam1.883398193123592082.515228998.05155934660.623895579.581.26170.335360.034055209O-Lauroyl-L-Carnitine1.86915969511324232.172767728.8087875926.9131311511.4750.69549-0.523890.035944949Spermidine1.852841338120732466.139803046.55171582506.322808280.641.42120.507090.0381964921-Aminocyclopropanecarboxylic acid1.82051639540101329.938304049.63525829331.4510359763.470.6441-0.634640.042933481-Methyladenosine1.8104802966839725.983667055.0151102708533152561.7161.50160.586550.044480671Uracil2.21567065519836247.49840144.88846083230.939062495.6512.32321.21610.002326177Benzoate2.12624417281870307.839151258.18106977597.311309713.61.30670.38590.004816Glyceric acid2.09231929524302405.533774684.22717040079.132262017.4710.70117-0.512170.00612824912(S),20-DiHETE2.0807155073752.9521476314.3158573120.5611566071.3341.68970.756770.006630225D-Glucose 6-phosphate2.04474069?44886202.4411609928.6824530598.626058084.3580.54651?-0.871690.00837171?2-Deoxyuridine2.0178595844122202.536623473.83546693070.0031590883.9761.62370.699250.009867962Thromboxane B22.0116717984420523.26898146.43072620621.935803562.57130.59283-0.754310.0102373422-Hydroxycinnamic acid1.8962649528509157.6621108940.49812302569.262675566.3831.44580.531870.019035913Phenylacetic acid1.8911658265646890.527551122.42844709700.295462600.20470.83403-0.261820.019515583(R)-2-Hydroxycaprylic acid1.8580039626829016.117378484.77287379163.703219985.46811.08060.111780.02284080512S-HHTrE1.81908832555533526.0913324876.9432017765.9614236797.540.57655-0.794490.027217148Aconitic acid1.7841436981241121409964294.758154753586.424393684.821.24690.318330.031607479Inosine1.777827653571250.7616156770.2624986939.9472323866.53831.72770.788840.032449298alpha-Ketoisovaleric acid1.76625996?74149376.558342249.88563623595.33926491.4050.85805?-0.220870.03403031?D-Glucuronic acid1.76391666951400584.386359798.21361798627.026550789.3461.20230.265790.03435682812(R)-HEPE1.75801757534267329985552406.16240271065.729394836.240.70117-0.512170.035188181L-Cystine1.723948545157820871.13603561.202142834726.913224017.70.90504-0.143940.040256967Itaconic acid1.70163021951132926.973547342.23361295644.578820095.7491.19880.261530.043830883Dodecanedioic acid1.70130790?4417552.348462254.97693412230.674819329.63370.77243?-0.372530.04388399?N2-Acetyl-L-ornithine1.66656782820869376.233305537.76228607530.116729850.0831.37080.455010.04986475

表3模型組與地榆鞣質(zhì)組小鼠血清中內(nèi)源性差異代謝物(n=10)

代謝物XM vs XR_VIP平均值-XM標(biāo)準(zhǔn)差-XM平均值-XR標(biāo)準(zhǔn)差-XR倍性變化倍性變化的log2PDiphenylamine2.1376325468347320335574947803217643470.90481-0.144320.004472Methyl linoleate2.134593165537841038463858372705180030993.52621.81810.004585N,N-Dimethylglycine2.0216665149825549923346112023033341311.18680.247130.01033DL-Methionine sulfoxide1.9758322375154645471603558003759416371.4980.583050.0136294-Guanidinobutanoic acid1.94657324004942892721145641298111022661.90130.927010.016067Argininosuccinic acid1.897138211122624232.37324631232999.60.89204-0.164820.0208179H-Xanthine1.874077121104421588446800989524365910.6614-0.59640.023318L-Valine1.8388961.27E+092.03E+081.68E+092.33E+081.32340.404250.027503Methyl(Indol-3-yl)Acetate1.8307237240863135932711.03E+08220582881.42890.514890.028541Cytarabine1.826273?5171946559560263955486070930710.7648?-0.386850.029117?N-Benzoylglycine1.777256397524141638546463976623117874671.60940.68650.035968Xanthosine1.741989119991521579853817689326979720.68146-0.553310.041492gamma-Glu-Ala1.730752383076911119918156158284105084741.4660.551860.043361(4S)-4-Hydroxy-L-isoleucine1.7275323217789640505163838664235505331.1930.254530.043906Phenylethylamine1.7224152401103025028173233936763734901.34690.429590.044781Benzaldehyde1.7113041079817716547971313485012648011.21640.282610.046721Dodecanedioic acid2.125468?2560026362006.344175524622551.7256?0.787090.000316?D-Glucose 6-phosphate1.979967?855796631540241944886202116099290.5245?-0.9310.002674?Salicylic acid1.9122022144845534062852814970014796931.31240.392250.005162Pyrocatechol1.89161274738614582805577275698059.22.031.02150.006152alpha-Ketoisovaleric acid1.861626?5387948480097717414937783422501.3762?0.46070.0078158?Pyrophosphate1.840597578116131061441533421045470112.65241.40730.0091473-Indolepropionic acid1.780171037859160614.91683767364774.41.62230.698080.013813Indoleacrylic acid1.7618842892325330749.54081339679398.31.41110.496810.015487Cinnamoylglycine1.756516721657146947311521404629037872.10821.0760.016003Dihydro-3-coumaric acid1.675536800807715424221697626960939742.11991.0840.025231L-Glutamate1.6719054.17E+08245768683.53E+08393259560.84656-0.240310.025711L-Histidine1.6497792.09E+08384789132.74E+08332231881.31380.393770.028768Sebacic acid1.6092831282759019475231592664816254001.24160.312190.034959Daidzein1.599691619063647673.72815894723253.11.73920.798430.036542

表4代謝物標(biāo)志物含量比較

標(biāo)志物XRXMD-Glucose 6-phosphate85579662.52±15402419.38?44886202.44±11609928.68?Dodecanedioic acid2560026.147±362006.3447?4417552.348±462254.97?alpha-Ketoisovaleric acid53879484.18±8009770.868?74149376.55±8342249.88?Cytarabine51719464.72±5956025.546?39554859.93±7093070.688 續(xù)表標(biāo)志物 XK XMD-Glucose 6-phosphate24530598.62±6058084.35?44886202.44±11609928.68?Dodecanedioic acid3412230.674±819329.63?4417552.348±462254.9769?alpha-Ketoisovaleric acid63623595.3±3926491.40?74149376.55±8342249.85?Cytarabine58180428.92±10028434.27?39554859.93±7093070.68?

3.4 潛在代謝標(biāo)志物及代謝路徑分析 通過(guò)結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行代謝途徑濃縮和拓?fù)浞治觯源_定可能受生物紊亂影響的代謝途徑，然后分析代謝物的代謝途徑。 用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析兩種差異代謝物的相關(guān)代謝途徑。所采用的數(shù)據(jù)分析算法是超幾何檢驗(yàn)，pathway拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)采用的是Relative-betweeness Centrality。選取impact>0.01的代謝路徑作為地榆鞣質(zhì)治療骨髓抑制最為相關(guān)代謝路徑，磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、糖酵解和糖異生、氨基酸和核苷酸代謝、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解6條代謝路徑(見(jiàn)表5)。為了實(shí)現(xiàn)地榆鞣質(zhì)治療骨髓抑制模型小鼠代謝的可視化，選擇與以上6條代謝路徑最為相關(guān)的4種差異代謝物作為地榆鞣質(zhì)治療骨髓抑制病癥潛在代謝標(biāo)志物，包含阿糖胞苷、D-葡糖糖-6磷酸、α-酮異戊酸、十二烷二酸。由圖5可以看出4種差異代謝物的代謝通路影響因子均大于0.01，D-葡糖糖-6磷酸的網(wǎng)絡(luò)可視化圖。

圖5 代謝通路影響因子和網(wǎng)絡(luò)可視化

表5地榆鞣質(zhì)影響的代謝途徑

途徑名稱impact-log(p)PFDR磷酸戊糖途徑0.069822.94420.052620.97679淀粉和蔗糖代謝0.167642.94470.52620.97679半乳糖代謝0.019492.63840.071430.97679糖酵解和糖異生0.035152.63840.0714370.09767氨基酸和核苷酸代謝0.089882.29730.100531.0纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解0.01192.27170.103141.0

4 討論

在正常情況下，骨髓中細(xì)胞的增殖、成熟和釋放與外周血液中的粒細(xì)胞的凋亡、破壞和排出呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。放化療沒(méi)有選擇性，在殺死大量腫瘤細(xì)胞同時(shí)也殺死部分正常的骨髓細(xì)胞，特別是對(duì)粒細(xì)胞有非常嚴(yán)重的影響，從而導(dǎo)致骨髓抑制，白細(xì)胞減少，甚至讓全血細(xì)胞減少。大多數(shù)化療藥物，常規(guī)劑量就能對(duì)骨髓產(chǎn)生高度毒性，通過(guò)引起骨髓造血機(jī)能的耗竭從而導(dǎo)致急性骨髓抑制的發(fā)生[7-8]。從骨髓抑制的發(fā)病原因來(lái)看，放化療對(duì)骨髓造血系統(tǒng)的破壞是機(jī)體白細(xì)胞下降的根本原因，因此，如何有效保護(hù)骨髓造血細(xì)胞是藥物抵抗放化療所致骨髓抑制的關(guān)鍵。鞣質(zhì)是地榆的主要有效成份，課題組前期研究表明，地榆鞣質(zhì)能有效升高白細(xì)胞數(shù)目?；诠撬枰种剖欠呕煴粍?dòng)減量或停藥的主要原因，本研究旨在評(píng)價(jià)地榆鞣質(zhì)對(duì)骨髓抑制的治療作用并結(jié)合代謝組學(xué)方法闡明其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)目明顯減少，表明模型組小鼠體內(nèi)發(fā)生了感染，此外模型組小鼠體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目較正常組明顯下降，表明模型組小鼠由于骨髓抑制致使骨髓中的造血干細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致白細(xì)胞下降。但經(jīng)地榆鞣質(zhì)治療后，上述指標(biāo)明顯回調(diào)接近正常組，骨髓抑制得以緩解，表明地榆鞣質(zhì)對(duì)骨髓抑制具有很好的治療效果。因此，研究認(rèn)為地榆鞣質(zhì)具有升高骨髓抑制小鼠白細(xì)胞的作用。

基于LC-MS代謝組學(xué)方法結(jié)合多變量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，本研究檢測(cè)并分析了各組小鼠的血清，并從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性代謝小分子層面探究地榆鞣質(zhì)治療骨髓抑制作用機(jī)制。 研究發(fā)現(xiàn)骨髓抑制小鼠經(jīng)地榆鞣質(zhì)干預(yù)后有四種差異代謝物可能是潛在代謝標(biāo)志物，主要涉及戊糖磷酸途徑，淀粉和蔗糖代謝，半乳糖代謝，糖酵解和糖異生，氨基酸和核苷酸代謝，纈氨酸 亮氨酸和異亮氨酸降解途徑。 這些潛在的代謝標(biāo)志物與代謝途徑直接或間接相關(guān)，共同構(gòu)成了地榆鞣質(zhì)治療骨髓抑制的代謝網(wǎng)絡(luò)。D-葡萄糖-6-磷酸是一種重要的糖基磷酸鹽，為糖代謝中重要的中間產(chǎn)物，是合成糖核苷酸的中間體，而糖核苷酸就是糖基轉(zhuǎn)移酶在催化各種糖激化反應(yīng)中重要的糖基供體[9]。D-葡萄糖-6-磷酸是生物細(xì)胞中常見(jiàn)的小分子，參與磷酸戊糖途徑與糖酵解等生化途徑。研究發(fā)現(xiàn)D-葡糖糖-6-磷酸在空白組和模型組，經(jīng)環(huán)磷酰胺造模后D-葡糖糖-6-磷酸含量下降，在代謝通路中D-葡糖糖-6-磷酸下降會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)抑制從而導(dǎo)致骨髓抑制，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)給予地榆鞣質(zhì)治療后D-葡糖糖-6-磷酸出現(xiàn)了回調(diào)，從而干預(yù)其作用機(jī)制來(lái)治療骨髓抑制。

α-酮異戊酸參與生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)，生成氨基酸，α-酮異戊酸是微生物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在循環(huán)中的位置位于異檸檬酸之后以及琥珀酰輔酶A之前。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-酮異戊酸在空白組和模型組，經(jīng)造模后α-酮異戊酸含量上升，在代謝通路中α-酮異戊酸含量上升會(huì)破壞氨基酸生成，三羧酸循環(huán)受到抑制從而導(dǎo)致骨髓抑制，經(jīng)給與地榆鞣質(zhì)治療后出現(xiàn)了回調(diào)的趨勢(shì)。

綜上所述，地榆鞣質(zhì)升高白細(xì)胞可能與調(diào)控磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、糖酵解和糖異生、氨基酸和核苷酸代謝、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解路徑有關(guān)。