張 康，張 璇，閆遵祥，王 磊，張 凱，張景艷，羅永江，仇正英，薛 歡，李建喜，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730050；2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；3.西安交通大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea viruses，BVDV)是黃病毒科瘟病毒屬的成員，其結(jié)構(gòu)是單股正鏈RNA基因組，大小約為12.3 kb[1-2]。BVDV通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，在病毒和宿主的蛋白酶共同水解和切割作用下，會(huì)形成12種成熟蛋白，包括P14(Core)、gp48(Erns)、gp25(E1)和gp53(E2) 4種結(jié)構(gòu)蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3]8種非結(jié)構(gòu)蛋白。目前該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布，許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家也有廣泛流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展[4-7]。Core蛋白是由糖胺聚糖共價(jià)結(jié)合組成的多肽鏈，在病毒侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用[8]。成熟的Core蛋白以病毒粒子結(jié)合形式存在，由90個(gè)氨基酸組成，并通過(guò)3種酶的作用將其從多聚蛋白鏈中切割下來(lái)。其中，Npro通過(guò)共翻譯自身蛋白水解加工形成Core蛋白氨基末端。隨后Core蛋白羧基末端的信號(hào)序列將其靶向運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。宿主酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中啟動(dòng)雙重加工，信號(hào)肽酶從Erns上將蛋白切割下來(lái)，釋放出的Core蛋白屬于高度堿性并被推測(cè)其與RNA具有結(jié)合性[9]。目前研究表明，Core蛋白的抗原表位不僅可以被B細(xì)胞識(shí)別，也可以被CD4T細(xì)胞識(shí)別[10]；BVDV Core基因重組腺病毒免疫小鼠后，產(chǎn)生的抗體與BVDV-1和BVDV-2均能產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，證明Core蛋白具有很好的免疫原性[11]。因此，為進(jìn)一步開(kāi)展Core蛋白的檢測(cè)和生物學(xué)功能研究工作，本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)得到了Core蛋白，純化后制備了兔抗Core蛋白多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 載體及菌株

Pet30a質(zhì)粒載體、BVDV NABL標(biāo)準(zhǔn)毒株、TOP10克隆菌株均來(lái)源于蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及酶

限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA聚合酶購(gòu)自Zoonbio公司；Tyrptone、Yeast Extract購(gòu)自O(shè)XOID公司；Agarose購(gòu)自上海基因公司；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；弗氏佐劑、Acr、Bis和Tris購(gòu)自Sigma公司；羊抗兔-HRP購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；SDS購(gòu)自Amresco公司；TEMED購(gòu)自BIO-RAD公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備及耗材

Allegra 21R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)BECKMAN公司；臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)SORVAL公司；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；PTC-200基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司；320-SpH計(jì)購(gòu)自美國(guó)Mettler Toledo公司；AR5120電子天平購(gòu)自美國(guó)AHOM S公司；MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia公司；酶標(biāo)儀、洗板儀購(gòu)自Thermo公司；NANODROP2000購(gòu)自Thermo公司；0.22 μm無(wú)菌濾器和透析袋購(gòu)自Millipore公司。

1.4 Core相應(yīng)基因片段的擴(kuò)增

按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取BVDV NADL標(biāo)準(zhǔn)毒株感染的牛腎細(xì)胞上清中的病毒RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后PCR擴(kuò)增BVDV Core基因。參考設(shè)計(jì)Core蛋白對(duì)應(yīng)基因序列(GenBank登錄號(hào)AJ133738.1)的上游引物: F：5′-CCGCATATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3′；下游引物R：5′-GCCCTCGAGTCCCATTGTAACTTGAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為324 bp，斜體部分為5′端添加的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)前為保護(hù)性堿基。

1.5 Core重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用Pet30a載體連接回收產(chǎn)物后轉(zhuǎn)至TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，并置于37 ℃水浴鍋中酶切，2 h后將酶切后的pet 30a載體片段進(jìn)行核酸電泳，并利用DNA膠回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化；利用XhoⅠ和NdeⅠ兩種酶按照上述方法對(duì)Core片段進(jìn)行酶切作用后，膠回收備用將純化的Core酶切產(chǎn)物用T4連接酶于4 ℃連接，12 h后將所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞，并將感受態(tài)細(xì)胞置于搖床中不含抗生素的LB培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng)45 min；用涂布棒將復(fù)蘇后的100 μL菌液均勻涂抹在含有卡那霉素的LB平板上，置于溫度為37 ℃條件下培養(yǎng)，12～16 h后選取單菌落并移至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基置于搖床中，于37 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng)4～6 h至菌液渾濁。將培養(yǎng)好的菌液送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為Pet30a-Core菌液于-80 ℃凍存。

1.6 Pet30a-Core的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10中，37 ℃ 220 r·min-1振搖至菌體D600為0.6～0.8；加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，37 ℃ 220 r·min-1振搖4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出培養(yǎng)物離心后，收集菌體，加入PBS進(jìn)行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)分析，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

1.7 重組蛋白Core的純化和透析

將鑒定可以成功表達(dá)的含有Pet30a-Core重組質(zhì)粒的菌液按1∶100的比例于500 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌液D值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，置于37 ℃恒溫?fù)u床中100 r·min-1振蕩誘導(dǎo)24 h，離心收集菌體。

將表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎后，加入細(xì)胞裂解液4 ℃ 10 000 r·mim-1離心20 min，收集沉淀。采用融合蛋白的Ni柱親和法純化透析復(fù)性，去除蛋白溶液中的咪唑等有害物質(zhì)，純化的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE分析，并用His單抗進(jìn)行Western blot鑒定，蛋白分裝保存于-80 ℃。

1.8 多克隆抗體的制備

以原核表達(dá)的BVDV Core蛋白進(jìn)行BCA濃度測(cè)定后，免疫2只新西蘭白兔(2.0～2.5 kg)，皮下免疫400 μg·次-1，2～3周免疫1次。采血檢測(cè)，通過(guò)間接ELISA方法確定抗血清針對(duì)BVDV Core蛋白的效價(jià)，待效價(jià)大于1∶50 000進(jìn)行最終采血制備抗血清。

1.9 兔抗Core蛋白多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

以純化的重組Core蛋白為包被抗原(包被濃度為5 μg·mL-1)，以免疫前的兔血清作為陰性對(duì)照，將純化后的抗體按1∶500～1∶512 000倍比稀釋?zhuān)?∶5 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，37 ℃恒溫箱1 h，以TMB顯色液，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。即刻在酶標(biāo)儀上450 nm讀數(shù)，將D值大于設(shè)定的陰性對(duì)照D值的2.1倍的孔對(duì)應(yīng)的稀釋度，判定為兔抗Core蛋白多克隆抗體的效價(jià)。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)多克隆抗體的反應(yīng)性

蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜，并在室溫下于5%脫脂奶粉中封閉2 h。于4 ℃條件下孵育1∶4 000倍比稀釋的抗Core多抗10 h，并利用TBST洗膜20 min·次-1，3次后加入1∶10 000稀釋的 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，于室溫條件下作用2 h，再次進(jìn)行TBST洗膜操作后使用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，并置于X光膠片暗室內(nèi)曝光。

1.11 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)多抗的反應(yīng)性

將成功感染BVDV的牛腎細(xì)胞和健康牛腎細(xì)胞固定后，分別將1∶200稀釋的抗Core多抗加入并孵育1 h，將FITC標(biāo)記的1∶200稀釋度的羊抗兔二抗加入并孵育1 h，封片并觀察熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 Core基因的PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒鑒定

以BVDV NADL標(biāo)準(zhǔn)毒株的RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、1%的核酸電泳后，可分別在324 bp左右出現(xiàn)一個(gè)特異性條帶，其分子質(zhì)量和預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒Pet30a-Core雙酶切后得到的基因大小為306 bp，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，DNA marker 4500；1，PCR產(chǎn)物；2，Pet30a-Core的NdeⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。M， DNA marker 4500; 1， PCR product; 2， Pet30a-Core digested by NdeⅠ and XhoⅠ.圖1 Core蛋白基因的PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定Fig.1 The PCR product of Core gene and identification of plasmid Pet30a-Core by restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白Core的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑取轉(zhuǎn)至TOP 10的Pet30a-Core陽(yáng)性單菌落加入到含有50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中置于37 ℃、220 r·min-1恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液D值在0.6～0.8時(shí)，按1∶2 000加入IPTG誘導(dǎo)24 h；將誘導(dǎo)后的菌液高壓破碎后SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況，圖2中的1-4結(jié)果顯示Core重組蛋白有表達(dá)且不可溶，圖2中的5至7為純化結(jié)果。

2.3 Core蛋白多抗效價(jià)測(cè)定結(jié)果

M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)的Pet30a-Core全細(xì)胞；2，誘導(dǎo)IPTG的Pet30a-Core全細(xì)胞；3，誘導(dǎo)IPTG后的Pet30a-Core上清；4，誘導(dǎo)IPTG后的Pet30a-Core沉淀；5～7，蛋白洗脫組分。M， Protein marker; 1， Uninduced Pet30a-Core whole cells; 2， Pet30a-Core whole cells induced with IPTG; 3， Pet30a-Core supernatant after inducted with IPTG; 4， Pet30a-Core precipitation after inducted with IPTG; 5-7， Eluted proteins from column.圖2 Core蛋白的表達(dá)和可溶性分析Fig.2 The expression of Core protein and solubility analysis

采集免疫后兔子血液，收集血清，采用間接ELISA的方法測(cè)定所獲得的Core蛋白多抗效價(jià)，結(jié)果可以看出多抗血清效價(jià)高于1∶512 000(圖3)。

2.4 Core兔源多抗的鑒定

于BVDV NADL株感染牛腎細(xì)胞后28 h，利用Western blot對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行電泳，或?qū)⒓?xì)胞固定進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，進(jìn)而測(cè)定Core蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。將1∶1 000稀釋的兔源Core多抗作為一抗，再將HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶10 000稀釋后作為二抗。Western blot電泳顯示，Core蛋白在BVDV感染的細(xì)胞中為陽(yáng)性，而在未感染BVDV的牛腎細(xì)胞中為陰性(圖4)。間接免疫熒光結(jié)果顯示：BVDV感染能利用多克隆抗體檢測(cè)到(圖5)。結(jié)果表明，本研究制備的Core兔源多抗可通過(guò)Western blot和IFA檢測(cè)到BVDV Core蛋白。

圖3 Core蛋白多克隆抗體效價(jià)Fig.3 Core titer of polyclonal antibodies

1～2，感染牛病毒性腹瀉病毒NADL株后的細(xì)胞上清；3，健康牛腎細(xì)胞上清。1-2， Cell supernatant after infected with BVDV NADL strain; 3， Healthy MDBK cell supernatant MDBK.圖4 Core蛋白多克隆抗體的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of Core polyclonal antibodies

1，Core蛋白多克隆抗體試驗(yàn)組；2，陰性對(duì)照組。1， Anti-Core polyclonal antibody group; 2， Negative control group.圖5 Core蛋白多克隆抗體的IFA鑒定Fig.5 IFA identification of Core polyclonal antibodies

3 討論

Core蛋白是黃病毒科病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，其N(xiāo)-端由Npro水解產(chǎn)生，C-端由宿主細(xì)胞的信號(hào)肽酶切形成[12]。在與BVDV同科的豬瘟病毒(CSFV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，Core蛋白對(duì)病毒的感染和增殖具有關(guān)鍵作用，其能抑制宿主細(xì)胞信號(hào)的表達(dá)，從而抑制宿主細(xì)胞代謝、增強(qiáng)病毒本身的侵入和增殖能力[13]。例如，CSFV的復(fù)制增殖過(guò)程中，血紅蛋白β亞基(HB)能夠起到抑制作用，它可以和視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ相互作用激活 IFN-β的表達(dá)，但是HB的表達(dá)又受到CSFV Core蛋白的抑制[14]。許多研究表明HCV的Core 蛋白可以被多種宿主蛋白結(jié)合，Core蛋白可以與T淋巴細(xì)胞表面的球狀C1q受體結(jié)合，抑制相關(guān)白介素基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制淋巴細(xì)胞的增殖[15]；和波型蛋白結(jié)合，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、傳遞過(guò)程以及病毒和細(xì)胞基因的表達(dá)、凋亡及脂質(zhì)代謝等[16-17]。目前，有關(guān)BVDV Core蛋白功能方面的研究很少，宮曉煒[18]首次提出了BVDV core蛋白與PIAS4結(jié)合有利于病毒復(fù)制和增殖，但引起這一現(xiàn)象的具體機(jī)制還需要深入的研究。因此，為了進(jìn)一步闡明BVDV Core蛋白在病毒持續(xù)性感染和抑制機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)理中的功能作用，需要建立Core的檢測(cè)工具。

本研究選擇大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，因該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高和低成本等優(yōu)點(diǎn)，常用來(lái)表達(dá)各種蛋白[19]；選用Pet30a原核表達(dá)載體，其帶有融合序列較短的His標(biāo)簽，能提高融合蛋白的表達(dá)量，便于后續(xù)蛋白純度檢測(cè)。本研究成功擴(kuò)增出Core基因片段，構(gòu)建了原核表達(dá)重組載體Pet30a-Core，該載體能大量表達(dá)融合蛋白Core蛋白，且蛋白以包涵體的形式存在，可能與其快速表達(dá)、體外缺少相關(guān)酶修飾等有關(guān)；由于Pet30a載體在Core蛋白基因的C端引入His標(biāo)簽，利用陽(yáng)離子(鎳離子)原理對(duì)Core蛋白進(jìn)行純化，獲得了高純度的目的蛋白。將蛋白免疫兔子后采集血清，使用間接ELISA的方法測(cè)定多抗效價(jià)高于1∶512 000，也證實(shí)Pet30a重組載體表達(dá)的蛋白具有較好的免疫原性[20]。Western blot結(jié)果顯示，多克隆抗體仍能很好的識(shí)別BVDV感染牛腎細(xì)胞后表達(dá)的Core蛋白。IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，抗體能識(shí)別Core蛋白的天然構(gòu)象表位，說(shuō)明具有類(lèi)似天然構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了BVDV Core蛋白，并進(jìn)行了純化和透析，得到大量高純度Core蛋白，且制備了針對(duì)Core蛋白的多克隆抗體。通過(guò)Western-blot和IFA檢測(cè)細(xì)胞中感染的病毒粒子和表達(dá)的病毒蛋白，證明制備的兔抗Core多克隆抗體具有很強(qiáng)的親和力，為下一步研究該蛋白的功能提供了良好的生物材料。