董新星，李明麗，崔藝佳，蘭國湘，王孝義，嚴(yán)達(dá)偉

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

Baughman等[1]和De Stefani等[2]兩個研究團隊發(fā)現(xiàn)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)位于線粒體內(nèi)膜上，是鈣離子通道的一個主要成分。研究表明：線粒體內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞生理學(xué)中起著重要作用[3]。而單向轉(zhuǎn)運復(fù)合體的調(diào)節(jié)因子是決定線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[4]。近幾年一些線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運體的調(diào)節(jié)分子如MCUR1(mithondrial calcium uniporter regulator 1)、MICU1(mitohondrial calcium uptake 1)等陸續(xù)被鑒定出來，其中MCUR1又被稱為CCDC90A，能夠通過與MCU相互作用調(diào)節(jié)線粒體對鈣的攝取[5-6]。一旦MCUR1表達(dá)缺失，MCU將無法維持正常線粒體的鈣離子水平，將會打破線粒體穩(wěn)態(tài)，從而引起疾病的發(fā)生。有研究表明，MCUR1基因上調(diào)導(dǎo)致線粒體鈣穩(wěn)態(tài)改變可能是引起腫瘤細(xì)胞惡性進展的始動因素。該基因可通過抑制肝癌細(xì)胞凋亡，加速肝癌細(xì)胞增殖，從而促進肝癌細(xì)胞的生長[7]。在MCUR1基因上調(diào)引起的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑中，凋亡相關(guān)蛋白p53是促進肝癌細(xì)胞生長的重要分子，并且與MCUR1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[8]。當(dāng)敲降MCUR1基因時可顯著促進慢性粒細(xì)胞白血病(慢性髓系白血病，chronic myeloid leukemia，CML)細(xì)胞系K562細(xì)胞的凋亡[9]。

目前，關(guān)于豬MCUR1基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究尚不清楚，本課題組前期簡化基因組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MCUR1與豬的生長性能存在聯(lián)系。本研究對撒壩豬MCUR1進行克隆與生物信息學(xué)分析，旨在揭示豬MCUR1基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)特征。運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在mRNA水平上的表達(dá)規(guī)律，豐富MCUR1基因的數(shù)據(jù)庫信息，為今后研究MCUR1基因在撒壩豬生長相關(guān)過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究采集撒壩豬的脾臟、胰臟、背脂、腎臟、肺、大腦、肝臟、心臟、背最長肌和大白豬的背最長肌，于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑及儀器

2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker、RNA提取試劑(Trizol)、cDNA第一鏈合成試劑盒、實時熒光定量PCR儀、熒光定量試劑SYBR Premix Dimer Eraser。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank上公布的豬的MCUR1基因序列(登錄號：XM_003128183.4 )，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，以ACTIN基因(登錄號：NM_001164650.1)作為內(nèi)參設(shè)計擴增引物，引物序列見表1，引物由北京擎科(昆明)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 RNA提取與cDNA合成

采用Trizol法分別提取撒壩豬的脾臟、胰臟、背最長肌和背脂等9種組織以及大白豬的背最長肌的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴增及克隆

以撒壩豬的肝臟組織樣cDNA為模板擴增MCUR1基因的CDS序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含ddH2O 11 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板0.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；于72 ℃后延伸8 min，4 ℃終止反應(yīng)。退火溫度依引物而異。經(jīng)檢測后的PCR擴增產(chǎn)物送至北京擎科(昆明)生物技術(shù)有限公司進行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)比對拼接后，獲得撒壩豬MCUR1基因完整CDS序列。該序列已提交到NCBI網(wǎng)站，獲得登錄號為：MN254967。

1.6 生物信息學(xué)分析軟件

采用上述得到的CDS序列，經(jīng)一系列預(yù)測分析獲得MCUR1基因的生物學(xué)信息。預(yù)測項目與軟件如表2所示。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

以撒壩豬不同組織cDNA作為模板，以ACTIN基因為內(nèi)參，實時熒光定量PCR檢測MCUR1基因在不同組織中的表達(dá)。取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管，反應(yīng)體系為25 μL∶2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1上下游引物2.0 μL(表1)，cDNA 2.5 μL，RNase-free水 8.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min為模板的預(yù)變性階段；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，共40個循環(huán)為模板的擴增階段，60 ℃→95 ℃，每15 s緩慢升溫0.3 ℃，建立熔解曲線階段。結(jié)果用2-△△Ct法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 撒壩豬MCUR1基因CDS的擴增及克隆

以撒壩豬肝臟組織cDNA為模板對MCUR1基因進行克隆，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別發(fā)現(xiàn)長度約582、599、476 bp的3條電泳帶(圖1)，經(jīng)拼接后，獲得1 095 bp的CDS區(qū)，與預(yù)期的目的條帶一致。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 撒壩豬MCUR1蛋白理化特性與疏水性分析

表1 引物序列信息

Table1Primer sequences information

基因Gene引物序列Primer sequence(5′→3′)片段長度Products length/bp退火溫度Tm/℃用途PurposeMCUR1-1F: CTCGCTCCTGCTGTCGGT58259.6普通PCR Normal PCRR:TCCTACTCCCAGAAGAGGTGAAMCUR1-2F: CGCTCCACCTATGCCTCC59962普通PCR Normal PCRR: CTCGGTGTCTATCTTCCTGTCCMCUR1-3F: ATCACGCTTCAGCAGTTA47660普通PCR Normal PCRR: AGGCAAAACAAAAGAATGMCUR1F: CTGTTCCTCGTCCTGCTTGTG32160實時熒光定量PCR Real-time PCRR: TAAGGCGTGGGTGTCAAAGTAGAACTINF: TGGTTCTGGGCTCTGTAAGGC19160實時熒光定量PCR Real-time PCRR: TGATGCCGTGTTCTATTGGGTA

表2 生物信息學(xué)分析工具

Table2Bioinformatics analysis tools

預(yù)測項目Predict subject軟件Software網(wǎng)址Website開放閱讀框Open reading frameNCBI OFR /蛋白理化性質(zhì)Physicochemical properties of proteinProtParam https://web.expasy.org/protparam/疏水性分析Hydrophobic analysisProtscale https://web.expasy.org/protscale/信號肽預(yù)測Signal peptide predictionSignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/跨膜區(qū)分析Transmembrane analysisTMHMM Server v.2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/亞細(xì)胞定位Subcellular localizationPsortⅡhttp://www.psort.org/psortb/Coil區(qū)分析Coil area analysisCOILS Serverhttps://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html磷酸化位點Phosphorylation siteNetPhos 3.1 Serverhttp://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/糖基化位點Glycosylation siteNetNGlyc 1.0http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/二級結(jié)構(gòu)Secondary structureSOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html三級結(jié)構(gòu)Tertiary structurePhyre2http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=in-dex進化樹The evolutionary treeMEGA6.0/功能結(jié)構(gòu)域Functional structural domainSAMRThttp://smart.embl.de/smart/job_status.pl?jobid=116547588181601533707646MhEAszEcjMCpG Island預(yù)測CpG Island predictionCpG Plot http://www.bioon.com.cn/doc/showarticle.asp?newsid=1115

經(jīng)ORF Finder程序預(yù)測顯示，撒壩豬MCUR1蛋白編碼364個氨基酸(圖2)。經(jīng)ProtParam在線軟件預(yù)測顯示：MCUR1蛋白分子式為C1787H2949N533O503S14，相對分子質(zhì)量40.398 ku，理論等電點(pI)為10.27，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)55.70，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為95.99，平均親水性為-0.213，屬于親水蛋白。

MCUR1蛋白的氨基酸組成如表3所示：其中含量最高的是丙氨酸(Ala)和精氨酸(Arg)，占全部氨基酸的10.2%。

經(jīng)Protscale程序預(yù)測撒壩豬MCUR1蛋白的疏水性，結(jié)果如圖3：第74位亮氨酸(Leu)疏水性最強(3.067)，第15位脯氨酸(Pro)親水性最強(-2.411)。

2.2.2 撒壩豬MCUR1蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析

運用SignalP軟件對撒壩豬MCUR1蛋白的信號肽進行預(yù)測。由圖4可知，S<0.5，表明撒壩豬MCUR1蛋白不存在信號肽。運用TMHMM Server v.2.0對撒壩豬MCUR1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行分析，預(yù)測結(jié)果(圖5)表明，MCUR1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 撒壩豬MCUR1基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of the PCR amplicons MCUR1 gene in Saba pigs

圖2 MCUR1基因ORF分析Fig.2 ORF analysis of MCUR1 gene sequence

表3MCUR1蛋白的氨基酸組成

Table3Amino acid composition of MCUR1 protein

氨基酸Amino acids個數(shù)Number占比Percentage%氨基酸Amino acids個數(shù)Number占比Percentage/%Ala (A)3710.2Arg (R)3710.2Asn (N)82.2Asp (D)113.0Cys (C)51.4Gln (Q)133.6Glu (E)246.6Gly (G)277.4His (H)51.4Ile (I)133.6Leu (L)5013.7Lys (K)226.0Met (M)92.5Phe (F)102.7Pro (P)184.9Ser (S)246.6Thr (T)184.9Trp (W)51.4Tyr (Y)51.4Val (V)236.3

圖3 撒壩豬MCUR1蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.3 The hydrophobicity profile of MCUR1 in pigs analyzed by Prot Scale in Saba pig

圖4 撒壩豬MCUR1蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of MCUR1 protein signal peptide in Saba pig

圖5 撒壩豬MCUR1蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果Fig.5 Transmembrane analysis of MCUR1 protein in Saba pigs

2.2.3 撒壩豬MCUR1蛋白亞細(xì)胞定位

通過在線軟件PsortⅡ分析預(yù)測豬MCUR1基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果如表4：該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，其次為細(xì)胞質(zhì)膜，在細(xì)胞壁和胞外少量分布。因此，可以推斷出撒壩豬MCUR1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

2.2.4 撒壩豬MCUR1蛋白卷曲螺旋預(yù)測與分析

通過COILS Server軟件預(yù)測撒壩豬MCUR1蛋白的卷曲結(jié)構(gòu)的結(jié)果如圖6:MCUR1蛋白含有2個典型的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2.5 撒壩豬MCUR1蛋白糖基化位點、磷酸化位點預(yù)測

運用 NetNGlyc 1.0 預(yù)測撒壩豬MCUR1蛋白N糖基化位點(圖7)，發(fā)現(xiàn)MCUR1蛋白沒有糖基化位點。運用NetPhos 3.1 Server 在線軟件預(yù)測MCUR1編碼蛋白磷酸化位點，結(jié)果如圖8所示：當(dāng)潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，MCUR1蛋白存在32個潛在的磷酸化位點，其中包含20個絲氨酸(Ser)位點、10個蘇氨酸(Thr)位點、2個酪氨酸(Tyr)位點。在撒壩豬MCUR1蛋白上可能有unsp、PKC、CaM-II、GSK3等15種保守的蛋白激酶結(jié)合位點，在102、141處unsp分值最高，為0.991。

2.2.6 撒壩豬MCUR1蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用ExPAsY的SOPMA程序預(yù)測撒壩豬MCUR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)如圖9所示：MCUR1蛋白α-螺旋區(qū)域有212個氨基酸，占58.24%，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域有15個氨基酸，占4.12%，無規(guī)則卷曲區(qū)域有110個氨基酸，占30.22%，延伸鏈區(qū)域有27個氨基酸，占7.42%。采用Phyre2對MCUR1蛋白同源建模獲得三級結(jié)構(gòu)模型，撒壩豬的MCUR1蛋白經(jīng)折疊、彎曲等一系列過程形成如圖10所示的三級結(jié)構(gòu)。

表4 撒壩豬MCUR1蛋白亞細(xì)胞定位分值

Table4Location score of MCUR1 protein in Saba pigs

位置Position分值Score細(xì)胞質(zhì)Cytoplasm7.50細(xì)胞質(zhì)膜Cytoplasmic membrane1.15細(xì)胞壁Cell wall0.62胞外Extracellular0.73

圖6 撒壩豬MCUR1蛋白卷曲螺旋預(yù)測結(jié)果Fig.6 Predicting results of MCUR1 protein crimp in Saba pigs

圖7 撒壩豬MCUR1蛋白的N-糖基化位點預(yù)測Fig.7 N-glycosylation sites of MCUR1 in Saba pigs

圖8 撒壩豬MCUR1蛋白的磷酸化位點預(yù)測Fig.8 The predicted results of MCUR1 encoding protein phosphorylation sites

圖9 撒壩豬MCUR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.9 Secondary structure of pig MCUR1 protein

圖10 撒壩豬MCUR1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Tertiary structure prediction of MCUR1 protein

2.2.7 撒壩豬MCUR1基因同源性比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

使用MegAlign對牛(XM_024983732.1)、雞(XM_418928.6)、狗(XM_418928.6)、山羊(XM_018039134.1)、人(NM_001031713.3)、猴(XM_010376415.1)、鼠(NM_001081059.3)、綿羊(XM_012115877.2)和豬(XM_005665577.3)的MCUR1基因編碼序列進行同源性分析，結(jié)果顯示(圖11)，豬MCUR1基因編碼區(qū)序列與牛、雞、狗、山羊、人、猴、鼠、綿羊的同源性分別為85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%。

用MEGA6.0軟件對9個物種進行進化樹分析，結(jié)果如圖12：撒壩豬與綿羊、山羊、牛的親緣關(guān)系較近，與雞的關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2.8 撒壩豬MCUR1基因CpG Island預(yù)測

運用CpG Plot在線軟件預(yù)測撒壩豬MCUR1基因的CpG Island，結(jié)果(圖13)顯示，撒壩豬的MCUR1在47～430堿基處有一個CpG Island。

2.2.9MCUR1基因組織表達(dá)分析

通過實時熒光定量PCR可知：撒壩豬MCUR1基因在不同組織中的表達(dá)量不同(圖14)，其中在肝臟中的表達(dá)量最多，在肺臟中的表達(dá)量最少。在大白豬的背最長肌中MCUR1的表達(dá)量高于撒壩豬的背最長肌(P<0.01)(圖15)。

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的鈣儲存場所之一[10-11]。通過線粒體內(nèi)膜的鈣離子流對細(xì)胞的生物能、胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡途徑的激活都具有調(diào)控作用[12-20]。近年來，鈣離子通道及相關(guān)蛋白成為研究熱點，其中MCU、MCUR1和MICU1成為研究的主要對象。MCUR1主要與MICU1、MICU2、MCU形成復(fù)合體調(diào)節(jié)線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運。研究證實，MCUR1的缺失會導(dǎo)致線粒體Ca2+濃度嚴(yán)重降低，過表達(dá)MCUR1會顯著促進線粒體Ca2+內(nèi)流，提高線粒體對胞質(zhì)Ca2+的緩沖能力[21]。MCUR1在維持正常細(xì)胞能量代謝中起重要作用，MCUR1的缺失會抑制細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化，使細(xì)胞能量產(chǎn)生不足，而引起細(xì)胞的自噬[21]。有報道顯示，MCUR1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平增加，進而增強線粒體Ca2+的攝取，抑制線粒體凋亡，從而促進肝癌細(xì)胞的增殖和存活[22]。原發(fā)性肝癌組織中，線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)分子MCUR1基因表達(dá)異常增高，高表達(dá)MCUR1的肝癌細(xì)胞其靜息水平的線粒體鈣離子濃度明顯上升，而過表達(dá)MCUR1不僅能夠激活線粒體鈣攝入，還能顯著促進細(xì)胞生長[7]。在多發(fā)骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者體內(nèi)，MCUR1基因表達(dá)上調(diào)，并通過抑制p53通路促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。在分子機制方面，沉默MCUR1基因后，p53表達(dá)升高，p53下游凋亡關(guān)鍵分子BCL2(B-cell lymphoma-2)降低，提示MCUR1促進MM細(xì)胞增殖有可能是通過抑制p53的表達(dá)實現(xiàn)的。多發(fā)性骨髓瘤的病因與發(fā)病機制至今雖尚未闡明，但是MCUR1基因有望成為多發(fā)性骨髓瘤診斷和治療的新靶點[23]。

圖11 撒壩豬與9個物種MCUR1基因編碼區(qū)同源性分析Fig.11 Homology analysis of MCUR1 gene CDS region between Saba pig and 9 kinds of species

圖12 基于9個物種MCUR1序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.12 System tree based on the sequence of MCUR1 of 9 species

圖13 撒壩豬MCUR1基因CpG Island預(yù)測Fig.13 Prediction of MCUR1 gene CpG Island in Saba pigs

圖14 MCUR1基因在撒壩豬不同組織中的表達(dá)量Fig.14 The expression of MCUR1 gene in different tissues of Saba pig

**表示差異極顯著(P<0.01)。** indicated the significant difference (P<0.01).圖15 MCUR1基因在撒壩豬和大白豬背最長肌中的表達(dá)量Fig.15 The expression of MCUR1 gene in Saba pig and Yorkshire

通過生物信息學(xué)分析顯示：MCUR1蛋白屬于親水蛋白，沒有信號肽，說明其不屬于分泌蛋白；不存在跨膜結(jié)構(gòu)，暗示該蛋白不是作為膜受體來發(fā)揮作用。亞細(xì)胞定位顯示，MCUR1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，說明該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)功能。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MCUR1蛋白是以α螺旋為主的混合型結(jié)構(gòu)蛋白，且結(jié)構(gòu)較簡單。在進化關(guān)系上，同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析都顯示，豬MCUR1基因與山羊、綿羊和牛的親緣關(guān)系是最近的。

細(xì)胞的生命活動中，線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。MCUR1作為線粒體Ca2+的調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞正常生命活動及各種疾病中發(fā)揮重要作用。目前大部分關(guān)于MCUR1基因的研究主要集中在調(diào)控線粒體Ca2+的攝取來影響細(xì)胞能量代謝與肝癌等疾病發(fā)生的相關(guān)過程中，在豬體內(nèi)的相關(guān)研究較少。本實驗通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MCUR1基因在撒壩豬各個組織中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：MCUR1在肝臟中的表達(dá)量最高，在肺臟中的表達(dá)量最低，推測豬體內(nèi)的MCUR1基因主要在肝臟中發(fā)揮其生物學(xué)功能。檢測該基因在大白豬和撒壩豬背最長肌中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，MCUR1基因在大白豬背最長肌中的表達(dá)量高于撒壩豬的背最長肌中的表達(dá)量(P<0.01)，大白豬相對于撒壩豬，其生長速度較快，這與本課題組通過簡化基因組得到的MCUR1基因定位于生長性狀相關(guān)功能上的信息一致。但是由于已有的研究結(jié)果有限，關(guān)于MCUR1基因在生長性狀過程中發(fā)揮的具體作用仍不清晰，需要進行大量的后續(xù)試驗來進行闡明。