★ 張曉男魏惠珍, 金浩鑫 呂尚 張丹 肖雄 朱敏 饒毅,

(1.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心 南昌 330006)

桃仁，薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種子，具有活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘的功效[1]。中藥配方顆粒是我國傳統(tǒng)中藥的現代化產物，它免除了傳統(tǒng)中藥繁瑣的煎煮過程，可直接服用，不僅保證了中藥飲片的藥效，還能夠根據中醫(yī)臨床辨證論治，隨癥加減，受到患者的普遍認可。但是，目前我國僅有6家企業(yè)試點且鮮有配方顆粒注冊審批，其主要原因是沒有建立穩(wěn)定可控的質量評價體系。

不確定度作為一種科學的統(tǒng)計手段，是與測量結果相關聯(lián)的、定量說明測量結果質量的一個參數，表征合理地賦予被測量值的分散性[2]。在本實驗中，采用測量不確定度的方法，定量評估桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量測定結果的可信度,為建立配方顆粒穩(wěn)定可行的質量評價體系提供數據依據。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(Waters，2695-2996);萬分之一電子天平(梅特勒，AB-104N);十萬分之一電子天平(島津，AUW-220D);苦杏仁苷對照品(110820，純度90.7%，購買于中國食品藥品檢定研究院);桃仁配方顆粒(自制，每克桃仁配方顆粒相當于12g飲片)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5μm)；流動相：甲醇-水(20∶80)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：210nm；進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備 取對照品約10mg，精密稱定置 50mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，再精密量取10mL置25mL量瓶中，用70%甲醇定容，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取桃仁配方顆粒(研細)約0.1g，精密稱取置具塞錐形瓶中，精密量取70%甲醇25mL，稱重，超聲30min，放冷，稱重，補重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2mL置10mL量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按“2.3”項下方法制備。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 取陰性溶液、對照品溶液、供試品溶液，按2.1項下色譜條件各進樣10μL,測定，見圖1。

A:陰性溶液;B:對照品溶液;C:供試品溶液;1為苦杏仁苷

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液一份，分別于0，2，4，8，12，24h各進樣10μL，記錄峰面積，RSD為1.09%，表明該溶液24h內穩(wěn)定。

2.5.3 精密度試驗 取苦杏仁苷對照品溶液連續(xù)進樣6次，RSD為0.39%，表明該儀器精密度較好。

2.5.4 線性試驗 配制6份不同濃度的苦杏仁苷對照品溶液(0.0078，0.0156，0.0390，0.0779，0.0974，0.1948 mg/mL)，進樣10μL，記錄其峰面積?？v坐標Y代表峰面積，橫坐標X表示苦杏仁苷的濃度，其回歸方程為Y=10 221 353.87X-1 784.30(r=0.9999)，說明苦杏仁苷在15.6～194.8μg/mL濃度范圍線性良好。

2.5.5 重復性試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份，進行測定，RSD為0.69%，說明該方法的重現性良好。

2.5.6 加樣回收試驗 取已知含量的桃仁配方顆粒粉末約0.05g六份，精密稱定，分別加入苦杏仁苷對照品(濃度為1.44mg/mL)，按“2.3”項下方法制備。結果顯示：回收率99.96%，RSD為0.80%，表明此方法有較好的準確性。

表1 桃仁配方顆粒加樣回收率試驗結果

3 不確定度評定[3-12]

圖2 不確定度因果關系圖

3.3 不確定度分量量化 由圖2可知，對桃仁配方顆粒含量測定結果產生影響的主要分為對照品引入的不確定度和樣品引入的不確定度。

3.3.1 對照品溶液引入的不確定度 對照品引入的不確定度由對照品質量u(mi)、對照品稀釋u(Vi)和對照品峰面積u(Ai)組成。

(1)對照品質量引入的不確定度u(mi)

①對照品純度引入的不確定度 由于對照品只顯示純度，沒有給出限度標識，忽略此項。

因為稱量是一次歸零稱量所得，且使用的是自動顯示數字的天平在一個很窄的范圍內進行的稱量，得到的質量差值靈敏度可以忽略不計。

(2)對照品溶液體積引入的不確定度u(Vi)

由“2.2”項下可知，在對照品溶液的配置過程中，對對照品溶液體積貢獻不確定度的有50mL量瓶、10mL移液管、25mL量瓶。

(3)對照品峰面積Ai引入的不確定度

3.3.2 供試品溶液引入的不確定度

(1)供試品質量引入的不確定度u(ms)

(2)供試品溶液體積引入的不確定度u(Vi)

(3)供試品峰面積As引入的不確定度

3.4 計算合成不確定度 由上述不確定度分量可知苦杏仁苷含量測定的相對標準不確定度為：

3.5 擴展不確定度 在95%置信概率下取包含因子k=2，則相對擴展不確定度U95(W)=k×u(X)=2×0.0083=1.66%。

實驗所測桃仁配方顆粒中苦杏仁苷的含量為142.17mg/g，故其擴展不確定度為:U95=142.17mg/g×0.0166=2.36mg。

3.6 報告不確定度 經過不確定度分析可知，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷的測量結果為(142.17±2.36)mg/g。

4 討論

苦杏仁苷是氰苷類物質，根據其性質，筆者考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇、70%乙醇溶液對桃仁配方顆粒中苦杏仁苷的提取率。結果表明，在70%甲醇和甲醇溶劑中的苦杏仁苷的含量較高。因苦杏仁苷易溶于醇且具有一定的水溶性，故選用70%甲醇溶液作為提取溶劑。后又考察不同提取溶劑量、提取方式和提取時間對桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量的影響，最終采用25mL、70%甲醇、超聲30min。

實驗過程中每個操作步驟都將會對測定結果產生一定的影響。通過對桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量測定的具體分析，可以看出各個不確定度分量對其含量均有影響。相對而言，供試品溶液的體積對實驗結果不確定度貢獻最大。在本實驗中，我們可以通過減少溶液稀釋次數比如供試品溶液的制備過程中可省去“取2mL續(xù)濾液加入10mL量瓶”這一步驟，將樣品直接稱量置100mL量瓶中，另一方面也可盡量使用容量大的玻璃量器比如可將“取2mL續(xù)濾液加入10mL量瓶”改為“取10mL續(xù)濾液加入50mL量瓶”以降低供試品溶液的體積引入的不確定度。利用不確定度理論對實驗過程中每一步驟具體分析，可將對實驗結果不確定度貢獻較大的某些步驟進行改善，進一步減小測量結果的不確定度。

另外本研究在方法摸索中發(fā)現目標峰附近有一雜質峰。查閱15版《中國藥典》得知，藥典中桃仁和苦杏仁均以苦杏仁苷為指標成分，但桃仁含量測定所用流動相為甲醇-水，提取方式為回流，而苦杏仁含量測定所用流動相是乙腈-0.1%磷酸溶液，提取方式為超聲。經深入研究發(fā)現，采用甲醇-水時，目標峰中實則包含苦杏仁苷(D-苦杏仁苷)和它的差向異構體(L-苦杏仁苷)兩部分，而采用乙腈-0.1%磷酸溶液或者乙腈-水溶液時，可將苦杏仁苷與其差向異構體分離。經實驗發(fā)現，采用回流提取時，苦杏仁苷的含量下降，而L-苦杏仁苷的含量會有所升高。然而，目前L-苦杏仁苷的生理活性、藥理作用、藥代動力學及與苦杏仁苷在臨床應用的區(qū)別等相關方面研究較少，但是苦杏仁苷及其差向異構體在不同的溫度、酸堿度及酶等條件下又可相互轉化[13-14]，所以桃仁、苦杏仁及郁李仁在進行含量測定時，需將苦杏仁苷與其同分異構體完全分離還是將兩者合并測其總含量，有待進一步研究。而在實驗操作中應嚴格控制實驗條件如溫度、酸堿度、濕度等對結果的影響，以減小引入的不確定度。

本文根據不確定度理論，對桃仁配方顆粒中苦杏仁苷的含量測定進行不確定度評價，得到其合成不確定度為0.83%，在95%的置信區(qū)間下含量測定的擴展不確定度為2.36mg，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷的測量結果為(142.17±2.36)mg/g。測量不確定度可以定量的描述實驗結果的可信度，能作為桃仁配方顆粒中苦杏仁苷定量測定結果的一種補充，并為其他中藥配方顆粒的質量控制研究提供有效參考。