★ 趙加茜 朱衛(wèi)豐 陳麗華 管詠梅 金晨 胡亞

(江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004)

馬錢(qián)子為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)(nux'vomica L.)的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫、鎮(zhèn)痛抗炎等功效，其主要有效部位為馬錢(qián)子總生物堿，其中馬錢(qián)子堿與士的寧是馬錢(qián)子總生物堿的主要成分[1-3]。白芍為毛茛科植物白芍(Paeonia lactiflora Pall)的去皮干燥根，具平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗之功效。研究發(fā)現(xiàn)馬錢(qián)子總堿和白芍總苷具有鎮(zhèn)痛抗炎等功效，兩藥配伍使用可發(fā)揮增效作用[4-5]。口服馬錢(qián)子總堿具有明顯的中樞毒性，治療劑量接近中毒劑量，故經(jīng)皮給藥為其常用的治療方式。貼膏劑屬于緩控釋外用制劑，具有載藥量大，給藥劑量可控，透氣性好等優(yōu)點(diǎn)，但也存在透皮吸收效果較差、不利于精確控制給藥劑量和給藥時(shí)間等問(wèn)題。促透劑可以調(diào)節(jié)皮膚通透性，提高藥物的經(jīng)皮滲透速率，以達(dá)到提高藥物生物利用度的目的，近年來(lái)天然中藥揮發(fā)油類(lèi)促透劑因其具有效果好、副作用小、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為促透劑研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[6]。薄荷醇為中藥薄荷揮發(fā)油中的主要成分，薄荷醇作為促透劑具有較好的促透效果，是目前研究較多的中藥揮發(fā)油類(lèi)促透劑[7-8]。本實(shí)驗(yàn)制備馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑，考察了不同濃度的薄荷醇為促透劑對(duì)馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑中馬錢(qián)子總堿體外經(jīng)皮滲透性的影響，以化學(xué)促透劑氮酮為陽(yáng)性對(duì)照，尋找薄荷醇的最佳促透濃度，為提高馬錢(qián)子總堿的體外經(jīng)皮吸收提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

TG328A 型分析天平(德國(guó)Sartoius公司)；TK-20B透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；TT-6D Franz擴(kuò)散池(天津正通科技有限公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

馬錢(qián)子總堿(自制，HPLC測(cè)定馬錢(qián)子總堿含量為66.4%)；白芍總苷(芍藥苷含量為50%，南昌貝塔生物科技股份有限公司)；馬錢(qián)子堿對(duì)照品(20mg/支，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)：BCGT-0209)；士的寧對(duì)照(50mg/支，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào): BCGT-0126)；薄荷醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，上海瑞永生物科技有限公司)；NP-700(國(guó)際特品ISP上海分公司)；甘羥鋁(日本協(xié)和化學(xué)有限公司，批號(hào)：SG-0344)；甘油(陜西太白山制藥有限公司)；檸檬酸(西隴化工股份有限公司)；CMC-Na(上海山浦化工有限公司)；PEG400(西隴化工有限公司)。

清潔級(jí)小鼠，體重約22g左右，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(贛) 2011-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑的制備 稱取處方量的馬錢(qián)子總堿、甘油、NP-700、CMC-Na、PEG400溶解于無(wú)水乙醇中，白芍總苷、甘羥鋁、檸檬酸溶解于超純水中，兩相混合攪拌形成凝膠狀，均勻涂布于無(wú)紡紗布上，40℃烘干4h，取出涼至室溫，表面覆蓋防黏膜，即得馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑。同法在各基質(zhì)和藥物溶解后將薄荷醇和氮酮溶解于無(wú)水乙醇中，可制備含1%，3%，5%薄荷醇和3%氮酮為促透劑的馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑。

2.2 馬錢(qián)子總堿含量測(cè)定

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定馬錢(qián)子堿對(duì)照品0.00126g、士的寧對(duì)照品0.00204g，置同一10mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得馬錢(qián)子堿與士的寧混合對(duì)照品溶液(每1mL含馬錢(qián)子堿126μg、士的寧204μg)。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為菲羅門(mén)Gimini C18(4.6mm×250mm，5μm) ，流動(dòng)相為緩沖鹽溶液( 0.01mol/L庚烷磺酸鈉和0.02mol/L磷酸二氫鉀等量混合，磷酸調(diào)pH2.8) -乙腈= 79:21，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，柱溫30℃。理論板數(shù)按馬錢(qián)子堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.空白透皮接收液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取馬錢(qián)子堿與士的寧混合對(duì)照品母液適量稀釋得0.95，1.51，3.24，4.32，10.81，21.60，43.20 μg/mL馬錢(qián)子堿對(duì)照品溶液和1.53，2.04，4.58，9.81，13.08，32.70，65.40μg/mL對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20μL，記錄馬錢(qián)子堿和士的寧峰面積，分別以馬錢(qián)子堿和士的寧質(zhì)量濃度(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸，得馬錢(qián)子堿回歸方程Y=16.751X-1.6542(r=0.9997)，線性范圍為0.95～43.20 μg/mL，士的寧回歸方程Y= 27.329X- 27.304(r=0.9996)，線性范圍為1.53～65.40 μg/mL。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取馬錢(qián)子堿和士的寧混合對(duì)照品溶液，在“2.2.2”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄馬錢(qián)子堿和士的寧的峰面積，結(jié)果顯示馬錢(qián)子堿和士的寧的峰面積的RSD分別為0.24%，0.18%，均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一馬錢(qián)子堿和士的寧透皮接收溶液6份，在“2.2.2”色譜條件下進(jìn)樣，記錄馬錢(qián)子堿與士的寧的峰面積，并計(jì)算RSD，結(jié)果表明馬錢(qián)子堿和士的寧質(zhì)量濃度的RSD分別為2.58%，0.44%，均小于5%，表明供試品溶液重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一馬錢(qián)子堿和士的寧透皮接收溶液，在“2.2.2”色譜條件下分別于0，2，4，8，12，24h進(jìn)樣，記錄馬錢(qián)子堿與士的寧的峰面積，結(jié)果表明馬錢(qián)子堿和士的寧質(zhì)量濃度的RSD分別為0.21%，0.33%，均小于5%，表明馬錢(qián)子堿和士的寧透皮接收溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定項(xiàng)良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取空白基質(zhì)皮膚透過(guò)液9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的馬錢(qián)子堿和士的寧對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度的供試品為3份，在“2.2.2”色譜條件下測(cè)定其質(zhì)量濃度，計(jì)算馬錢(qián)子堿和士的寧的加樣回收率，結(jié)果馬錢(qián)子堿低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為101.87%，99.03%，96.95%，RSD分別為0.45%，0.82%，2.24%；士的寧低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為104.0%，98.03%，98.42%，RSD分別為1.31%，1.81%，0.29%。

2.3 貼膏劑物理性質(zhì)評(píng)價(jià)

2.3.1 粘附力測(cè)試 按照《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定的粘附力測(cè)定法測(cè)定貼膏劑的初黏力、持黏力和剝離強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)前，將6片馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑放置在溫度25℃，相對(duì)濕度60%的恒溫恒濕箱中2h。采用滾球斜坡停止法測(cè)定貼膏劑初黏力，將貼膏劑固定在傾斜角30°的傾斜板上，粘性面朝上，以貼膏劑粘性面粘住的最大號(hào)鋼球評(píng)價(jià)貼膏劑的初黏力。將貼膏劑黏性面粘貼于試驗(yàn)板表面，垂直放置，沿供試品的長(zhǎng)度方向懸掛一規(guī)定質(zhì)量的砝碼，記錄供試品完全從試驗(yàn)板脫落的時(shí)間，評(píng)價(jià)貼膏劑的持黏力。采用180°剝離強(qiáng)度試驗(yàn)法測(cè)定貼膏劑的剝離強(qiáng)度，將貼膏劑粘性面粘接在試驗(yàn)板上，用2kg重壓輥在供試品上來(lái)回滾壓三次后在室溫下放置20min后進(jìn)行剝離強(qiáng)度測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑能夠粘住11號(hào)鋼球，持黏力測(cè)定顯示馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑的脫落時(shí)間≥400s，剝離強(qiáng)度為3.25±0.80N。

2.3.2 賦型性試驗(yàn) 制備好的貼膏劑放置在37℃、相對(duì)濕度64%的恒溫恒濕箱中30min后，固定在傾斜角為60°的傾斜板上放置24h，觀察貼膏劑是否有流淌現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑賦型性良好，膏體無(wú)任何流淌現(xiàn)象。

2.3.3 綜合感官評(píng)價(jià) 通過(guò)盲法評(píng)分法對(duì)貼膏劑的皮膚膜殘留、皮膚追隨性、膏體性狀和透布程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。皮膚膜殘留：將貼膏劑從皮膚表面掀開(kāi)后，皮膚表面無(wú)殘留、膏面無(wú)破損者為滿分；皮膚追隨性：將貼膏劑貼于手背表面，均勻用力甩動(dòng)三次，貼膏劑均無(wú)掉落計(jì)滿分；膏體性狀：膏體軟硬適中，涂展性好，無(wú)顆粒狀膠團(tuán)和氣泡計(jì)滿分；透布程度：眼睛觀察無(wú)透布現(xiàn)象記滿分。每個(gè)項(xiàng)目滿分為5分，按照分?jǐn)?shù)分按照等級(jí)依次計(jì)5、4、3、2、1分，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，制備3批次的貼膏劑皮膚追隨性較好，貼于膚表面膏體無(wú)殘留，制備的膏體無(wú)明顯氣泡和顆粒狀膠團(tuán)，無(wú)明顯透布現(xiàn)象。

表1 貼膏劑綜合感官評(píng)分表

2.4 體外經(jīng)皮滲透評(píng)價(jià)

2.4.1 離體皮膚的制備 取健康雄性小鼠，麻醉后用電動(dòng)剃毛器剃掉腹部毛后剝離小鼠腹部皮膚，生理鹽水清洗皮下脂肪組織和粘連物，錫箔紙包裹后-20℃冷凍保存，使用前用生理鹽水浸泡自然解凍，皮膚一周內(nèi)用完。

2.4.2 滲透擴(kuò)散裝置 透皮吸收滲透擴(kuò)散裝置采用改良Franz擴(kuò)散池。擴(kuò)散池由兩部分組成，上室為擴(kuò)散室，下室為接收室，接收池容積為12mL，選擇20%乙醇生理鹽水為透皮接受液，擴(kuò)散池?cái)U(kuò)散面積為1.85cm2，水浴循環(huán)溫度維持在(37.0±0.5)℃，設(shè)置轉(zhuǎn)速為150r/min，取樣量為1mL。

2.4.3 體外透皮實(shí)驗(yàn) 剪取面積大于擴(kuò)散池表面積的小鼠皮膚，放置在Franz擴(kuò)散池的供給池與接收池結(jié)合處，皮膚角質(zhì)層朝向供給池，并用彈簧夾固定擴(kuò)散池和供給池，用20%乙醇生理鹽水平衡30min后給藥，分別取未加促透劑、1%，3%，5%薄荷醇和3%氮酮為促透劑的馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑適量，均勻地涂抹在離體小鼠皮膚表面，使藥物與鼠皮充分接觸，保持轉(zhuǎn)速與水浴循環(huán)溫度。于1，2，4，6，8，10，12，24h取1mL接收液(同時(shí)補(bǔ)充相同溫度的接收液1mL)，將取出的接收液10000r/min的速度離心10min，離心后的上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，在“2.2.2”色譜條件下測(cè)定馬錢(qián)子堿和士的寧的含量，并計(jì)算馬錢(qián)子堿和士的寧的累積透過(guò)量Qn，計(jì)算公式為：Qn=(Vpn+ ΣpiVii)/A。其中A為有效擴(kuò)散面積，V為接受液總體積，ρn為第n次取樣時(shí)接受液中藥物的質(zhì)量濃度，ρi為第i次取樣時(shí)接受液中藥物的質(zhì)量濃度，Vi為取樣體積；以藥物的累積透過(guò)量Q24(μg·cm-2) 對(duì)取樣時(shí)間t作曲線，并對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js(μg·cm-2/h) 。利用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、表2、表3。

透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取下小鼠皮膚，用生理鹽水洗凈小鼠皮膚表面的貼膏劑，并剪下給藥部分，剪刀剪碎后加入甲醇1mL渦旋5min，超聲提取30min，4000r/min離心10min。離心后的上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。在“2.2.2”色譜條件下測(cè)定馬錢(qián)子堿和士的寧的含量，計(jì)算藥物的皮膚滯留量Qs(μg·cm-2)，計(jì)算公式為：Qs=Vp/A。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

圖2 不同馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏中馬錢(qián)子堿的

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，制備的馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑膏體無(wú)明顯氣泡和顆粒狀膠團(tuán)，無(wú)明顯透布現(xiàn)象，皮膚追隨性較好，貼于膚表面膏體無(wú)殘留，粘附力符合要求，賦型性良好。體外透皮實(shí)驗(yàn)顯示馬錢(qián)子堿的24h累積透過(guò)量為3%薄荷醇>5%薄荷醇>1%薄荷醇>3%氮酮>陰性對(duì)照，士的寧24h累積透過(guò)量為3%薄荷醇>5%薄荷醇>3%氮酮>1%薄荷醇>陰性對(duì)照，結(jié)合圖2和圖3，表明薄荷醇能夠有效促進(jìn)馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏中馬錢(qián)子堿與士的寧的體外滲透吸收，3%薄荷醇的促透效果最佳。由表2和表3可知，3%，5%薄荷醇為促透劑時(shí)，馬錢(qián)子堿和士的寧的穩(wěn)態(tài)滲透速率比3%氮酮為促透劑時(shí)分別提高了3.64，3.05倍和2.79，2.61倍，表明3%和5%薄荷醇的促透效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照3%氮酮。以薄荷醇為促透劑時(shí)，馬錢(qián)子堿與士的寧的皮膚滯留量均有所增加，表明薄荷醇能夠增加馬錢(qián)子與士的寧的藥物儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。

3 討論

馬錢(qián)子總堿毒性較大，其毒性機(jī)制主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，臨床上常采用經(jīng)皮給藥的方式使用。馬錢(qián)子外用制劑能夠避免肝臟首過(guò)效應(yīng)，減少馬錢(qián)子總堿的毒副作用，但傳統(tǒng)馬錢(qián)子外用制劑生物利用度較低，不能確保足夠量的藥物透過(guò)皮膚進(jìn)入人體內(nèi)以達(dá)到有效的血藥濃度。近年來(lái)有研究采用脂質(zhì)體、囊泡等作為馬錢(qián)子總堿外用制劑的載體，能夠提高馬錢(qián)子總堿的透皮性能，但臨床應(yīng)用較少[9-10]。

馬錢(qián)子類(lèi)生物堿屬于單萜吲哚類(lèi)生物堿，馬錢(qián)子總堿中的主要成分馬錢(qián)子堿和士的寧是脂溶性藥物，相對(duì)分子質(zhì)量較小，但皮膚角質(zhì)層特殊的“磚墻”結(jié)構(gòu)是馬錢(qián)子總堿經(jīng)皮吸收的主要屏障，增加馬錢(qián)子總堿透過(guò)皮膚角質(zhì)層的速率是提高馬錢(qián)子總堿的透皮吸收利用的關(guān)鍵[8]。研究表明促透劑能夠破壞角質(zhì)層間隙脂質(zhì)的有序排列，增加脂質(zhì)的流動(dòng)性，提高藥物的擴(kuò)散系數(shù)，可逆地改變皮膚角質(zhì)層的屏障功能，使藥物通過(guò)皮膚角質(zhì)層到達(dá)靶組織，因此在外用制劑中加入促透劑能夠顯著提高藥物的經(jīng)皮滲透速率，使藥物達(dá)到有效的血藥濃度[11-14]。薄荷醇是中藥薄荷揮發(fā)油的主要成分，屬于中藥萜烯類(lèi)化合物，與氮酮等化學(xué)促透劑相比，薄荷醇具有促透效果好、時(shí)滯短、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究得最為廣泛的中藥揮發(fā)油類(lèi)促透劑之一。薄荷醇對(duì)脂質(zhì)分子疏水鏈具有較好的親和力，薄荷醇透過(guò)皮膚時(shí)，皮膚表皮與正常皮膚比較皺褶明顯增多，最外層角質(zhì)層脫落明顯，呈帶狀游離分布，角質(zhì)層間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，脂質(zhì)正常有序的板層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯增厚的紊亂排列和中等致密的凝絮塊狀結(jié)構(gòu)[16]。FTIR研究分析發(fā)現(xiàn)薄荷醇透過(guò)皮膚時(shí)皮膚脂質(zhì)碳?xì)洳粚?duì)稱吸收峰和對(duì)稱吸收峰信息發(fā)生改變，推測(cè)薄荷醇能夠加速表皮角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)變化，可逆性破壞角化細(xì)胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致皮膚對(duì)外來(lái)藥物的阻滯作用降低，使藥物更容易經(jīng)過(guò)表皮細(xì)胞間空隙擴(kuò)散。

表2 不同馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑中馬錢(qián)子堿的滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)±s,n=5)

表3 不同馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏劑中士的寧的滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)±s,n=5)

圖3 不同馬錢(qián)子-白芍配伍貼膏中士的寧的

薄荷醇具有一定的鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎的功效，能夠興奮人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)痛和風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛具有明顯的緩解作用，這與馬錢(qián)子生物堿鎮(zhèn)痛抗炎的藥理作用相似，因此選擇薄荷醇作為促透劑不僅可以提高馬錢(qián)子總堿的促透效果，而且還可以起到協(xié)同增效的作用，有助于馬錢(qián)子藥效的發(fā)揮和療效的提升[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薄荷醇不僅能夠提高馬錢(qián)子總堿的經(jīng)皮滲透速率，還可以增加馬錢(qián)子總堿的皮膚滯留量，形成藥物儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)，除去貼膏后仍有藥物從皮膚釋放，從而可以延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，這為薄荷醇作為一種促透劑及馬錢(qián)子總堿外用制劑的處方優(yōu)化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。