童國相 王莎 高國應 何一偉 李瓊

長沙醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院內分泌科 410219

Apelin 是血管緊張素受體AT1 相關受體蛋白( putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ) 的內源性配體［1］。其主要存在于心臟、腎、肺的大血管內皮細胞中，在腎上腺細胞、血管平滑肌細胞、神經(jīng)細胞、結締組織等中也有表達。Apelin也存在于脂肪組織中，是其中的一種脂肪因子［2］。Apelin的前體肽源包含77 個氨基酸殘基，羧基C 末端為合成肽序列，可被肽酶分解成多種成熟的Apelin活性肽，包括Apelin-10、11、12、13、15、17、19、28、36 等，其中Apelin-13的生物活性最強［3］。既往研究顯示，Apelin在控制血壓，增強心肌收縮力，調節(jié)體液平衡，促進垂體激素分泌和調節(jié)免疫等生物學效應中均發(fā)揮著不同程度的作用［4-7］。此外，Apelin在肥胖、脂肪細胞代謝中同樣具有重要調節(jié)作用。Guo 等［8］研究顯示，Apelin-13在體外可以降低肥大脂肪細胞的脂質貯積，可能的作用機制為通過磷脂酰肌醇3 激酶信號通路上調水通道蛋白7 的表達。Sawane等［9］在高脂飲食誘導肥胖小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Apelin基因敲除小鼠的體重及皮下脂肪層厚度、脂肪細胞直徑顯著高于高脂飲食野生型小鼠。Apelin 基因轉染則可以降低高脂飲食的作用。Apelin基因敲除小鼠在肥胖發(fā)生過程中，可以出現(xiàn)腸系膜淋巴管增生與擴張。Apelin基因轉染抑制了高脂飲食誘導的淋巴管數(shù)量和通透性的增加。結果表明，Apelin通過增強淋巴管和血管的完整性，從而抑制肥胖。本研究通過在3T3-L1 前體脂肪細胞增殖、分化過程中，予以Apelin-13干預，探討Apelin-13對脂肪細胞增殖、分化的影響，并初步探討其可能的作用機制。具體報道如下。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器 3T3-L1前體脂肪細胞購自于中國科學院上海細胞庫; Apelin-13購自于上海齊一生物科技有限公司; DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤( IBMX) 、地塞米松、胰島素，四甲基偶氮唑鹽( MTT) 檢測試劑盒、油紅O 染液、甘油三酯檢測試劑盒購自于北京鼎國昌盛生物科技有限公司;實時熒光定量PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成; Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司; 過氧化物酶體增殖物活化受體( PPAR) γ 抗體、HRP 標記的二抗，總蛋白提取試劑盒和蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司; CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;離心機購自美國Sigma公司; FlexStation 3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司; IX51倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司; PE2400 型多功能PCR 儀購自美國Perking公司; 電泳槽、電泳儀、化學發(fā)光熒光成像系統(tǒng)等購自美國Bio-Rad公司。

1．2 研究方法

1．2．1 3T3-L1 前體脂肪細胞培養(yǎng) 3T3-L1前體脂肪細胞置于DMEM 高糖培養(yǎng)液( 含10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素和鏈霉素) ，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每2 天更換培養(yǎng)液。

1．2．2 MTT 法檢測3T3-L1 前體脂肪細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞，以5 000 個/孔接種至96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液100 μl/孔，置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁后輕輕吸棄上清液。分別予以濃度為5、10、20、40、50、100 μmol/L的Apelin-13進行干預，每組6 個復孔，并設置空白對照孔。干預24、48、72、96 h后，分別每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃溫育，棄去孔內液體，避光振蕩10 min后，在酶標儀上以490 nm 波長測定各孔吸光度值( A 值) 。各濃度平行孔A 值均值減去空白對照孔A 值均值后，按照細胞存活率(%) =( A實驗孔－A空白孔) /A空白孔×100%。

1．2．3 “經(jīng)典雞尾酒法”誘導3T3-L1前體脂肪細胞分化及干預 取對數(shù)生長期細胞，以5 000個/孔接種至96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液100 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。待3T3-L1前體脂肪細胞融合后，將培養(yǎng)液換為含0．5 mmol/L IBMX、0．25 μmol/L 地 塞 米 松 和10 mg/L胰島素的DMEM 高糖培養(yǎng)液。2 d 后再更換為含10%胎牛血清、10 mg/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 d。隨后以不含任何誘導劑的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d 至分化完成。培養(yǎng)液每2 天更換1 次。誘導分化第8 天，95%以上的細胞可分化為具有脂肪細胞表型的成熟脂肪細胞。將對數(shù)生長期細胞分為實驗組和對照組。實驗組分別于誘導分化第2、4、6、8 天更換培養(yǎng)液的同時，予以細胞存活率抑制作用最強的Apelin-13濃度進行干預。對照組不做處理。

1．2．4 油紅O 染色和甘油三酯含量檢測 于誘導分化第8 天，分別取兩組成熟脂肪細胞，采用油紅O染色法室溫染色2 h。倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。然后加入異丙醇處理染色的細胞，通過酶標儀在510 nm波長下測定吸光度( OD) 值，計算脂質含量。嚴格按照說明書，使用甘油三酯檢測試劑盒測定甘油三酯含量。

1．2．5 RT-PCR 檢測PPARγ mRNA表達變化 于誘導分化第2、4、6、8 天，分別收集兩組細胞。經(jīng)胎牛血清洗滌后，Trizol法提取3T3-L1 前體脂肪細胞總RNA，紫外分光光度計測定總 RNA 濃度，A260/A280值在1．8 ～2．0。逆轉錄合成cDNA，使用SYBR Green染色法進行RT-PCR，檢測PPARγ mRNA水平。上游引物: 5'-GTGATGGAAGACCACTCGC-3';下游引物:5'-CCCACAGACTCGGCACTC-3'。PCR反應總體積為10 μl。反應條件為:50℃2 min;預變性95℃5 min; 循環(huán)95℃30 s，60℃30 s，PCR 儀上擴增40 個循環(huán)。以18s RNA作為內參。采用公式2－△△CT計算mRNA 相對表達量，分析表達量的差異。

1．2．6 Western 印跡檢測PPARγ 蛋白表達變化于誘導分化第2、4、6、8 天，分別提取兩組3T3-L1前體脂肪細胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后，每泳道上樣40 μg蛋白，電泳后轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，加入PPARγ抗體，室溫搖床孵育2 h，加入HRP 標記二抗孵育30 min，以β-actin作為內參。檢測條帶用化學發(fā)光熒光成像系統(tǒng)掃描灰度值。

1．3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22．0 軟件處理，正態(tài)分布的計量資料采用x ±s 表示。計量資料兩兩比較采用t 檢驗分析。P ＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 Apelin-13 對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響Apelin-13濃度越高，干預時間越長，3T3-L1前體脂肪細胞的存活率越低。以100 μmol/L Apelin-13 干預96 h 后，3T3-L1前體脂肪細胞的存活率最低( 圖1) 。

圖1 不同濃度Apelin鄄13 對3T3鄄L1 前體脂肪細胞增殖的影響

2．2 Apelin-13 對3T3-L1前體脂肪細胞分化的影響油紅O 染色結果顯示，誘導分化第8 天，兩組細胞核周可見大量紅色“戒環(huán)”樣脂滴，見圖2( 封3) 。經(jīng)Apelin-13干預的3T3-L1前體脂肪細胞脂滴、脂質和甘油三酯含量均明顯少于對照組( t=4．526、5．353、4．827，P 均＜0．05)，見圖3。

圖2 Apelin鄄13 對3T3鄄L1 前體脂肪細胞分化的影響（油紅O 染色，200×）

圖3 Apelin鄄13 對3T3鄄L1 前體脂肪細胞分化的影響

2．3 Apelin-13 對PPARγ mRNA表達的影響 如圖4，與對照組相比，誘導分化第6、8 天，經(jīng)Apelin-13干預的3T3-L1前體脂肪細胞PPARγ mRNA表達量顯著下降( t=4．962、5．416，P 均＜0．05) 。

2．4 Apelin-13 對PPARγ 蛋白表達的影響 如圖5，與對照組相比，誘導分化第6、8 天，經(jīng)Apelin-13干預的3T3-L1前體脂肪細胞PPARγ蛋白表達量顯著下降( t=4．734、5．627，P 均＜0．05) 。

圖4 實驗組和對照組PPARγ mRNA 表達的比較

圖5 實驗組和對照組PPARγ 蛋白表達的比較

3 討論

肥胖以體內白色脂肪組織過度積聚為重要特征，與2 型糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。肥胖不僅影響生活質量，減少預期壽命，同時也給患者的家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔［10］。因此，肥胖一直是臨床研究的熱點與難點。

Apelin 是APJ 的內源性配體，在多種細胞中均有表達。白色脂肪組織是重要的內分泌組織，可分泌瘦素、脂聯(lián)素、網(wǎng)膜素等多種脂肪因子。Apelin也是白色脂肪組織分泌的眾多脂肪因子中的一種［11］。近年來多項研究表明，Apelin在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調節(jié)作用。Boal等［12］研究顯示，在高脂飲食喂養(yǎng)的心臟缺血/再灌注小鼠中，靜脈注射Apelin-13顯著減少了心肌梗死面積、細胞凋亡和線粒體損傷。在H9C2心肌細胞系和原代心肌細胞中，Apelin-13可以誘導叉頭框蛋白O1( FOXO1) 磷酸化和核排斥，通過siRNA沉默F(xiàn)OXO1，可消除Apelin-13對缺氧誘導細胞凋亡和線粒體活性氧簇生成的保護作用。小鼠Apelin缺陷導致心肌FOXO1表達減少，F(xiàn)OXO1分布受損。Yang 等［13］體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，肺腺癌細胞過表達APJ，Apelin-13能顯著增加細胞外信號調節(jié)激酶1/2 的磷酸化以及細胞周期蛋白D1、微管相關蛋白1 輕鏈3A/B( LC3A/B) 和自噬相關基因Beclin1的表達，并誘導肺腺癌細胞的增殖和自噬。Bülbül等［14］研究證實，在大鼠體內，Apelin-13可以通過迷走神經(jīng)膽堿能通路抑制胃腸道運動。

白色脂肪組織的主要成分為前體脂肪細胞和脂肪細胞，還包括滲透入白色脂肪組織的內皮細胞、巨噬細胞、血管神經(jīng)等非脂肪細胞和組織［15］。肥胖發(fā)生的生物學基礎是白色脂肪組織內前體脂肪細胞增殖、分化，導致脂肪細胞體積和數(shù)量的增加。體積變化與前體脂肪細胞增殖和脂解的平衡相關，而數(shù)量變化則與前體脂肪細胞分化和凋亡密切相關［16］。Than等［17］研究顯示，Apelin-APJ信號通路通過磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 和AMP 活化蛋白激酶信號通路，增加棕色脂肪形成和熱原性轉錄因子的表達，從而促進棕色脂肪細胞分化。Apelin可以減輕腫瘤壞死因子-α對棕色脂肪生成的抑制作用，促進棕色脂肪細胞PPARγ協(xié)同刺激因子1α 和解耦聯(lián)蛋白1 的表達增加。此外，Apelin還能夠增加白色脂肪細胞的棕色化，從而發(fā)揮抗肥胖的作用。本研究首次在3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化過程中，予以Apelin-13干預，結果表明，Apelin-13能抑制3T3-L1前體脂肪細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性。油紅O 染色檢測脂質含量和甘油三酯含量的結果表明，Apelin-13能抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中脂滴的形成，減少脂質聚集和甘油三酯含量。

在前體脂肪細胞分化過程中，PPAR、CCAAT增強子結合蛋白α、脂肪細胞蛋白2 等轉錄因子發(fā)揮重要的調控作用［18-19］。其中，PPAR是核激素受體家族中的配體激活受體，根據(jù)結構的不同，PPAR可分為α、β 和γ 3 種類型。其中PPARγ主要表達于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，具有脂肪組織特異性，是體內脂肪形成所必需的轉錄因子，能被脂肪酸及外源性過氧化物酶體增殖物激活，調控脂代謝酶的表達，從而導致前體脂肪細胞最終的分化，脂滴形成，脂質聚集［20］。因此，PPARγ在前體脂肪細胞分化中起著重要的調節(jié)作用。本研究首次通過檢測Apelin-13干預的3T3-L1 前體脂肪細胞誘導分化過程中PPARγ mRNA和蛋白的表達變化，發(fā)現(xiàn)Apelin-13 能下調3T3-L1前體脂肪細胞PPARγ mRNA和蛋白的表達。此可能為Apelin-13抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化的作用機制。

綜上，Apelin-13 呈濃度和時間依賴性抑制3T3-L1前體脂肪細胞的增殖，并抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中脂滴的形成，減少脂質聚集和甘油三酯含量。其可能的作用機制為通過抑制3T3-L1前體脂肪細胞分化相關調控因子PPARγ 的表達。