摘 ?要：微生物廣泛分布于水、空氣、土壤等多種環(huán)境介質(zhì)中，并在其中發(fā)揮重要作用。當(dāng)今微生物分析標(biāo)準(zhǔn)主要方法仍是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，然而，培養(yǎng)法存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、特異性差、敏感度不高、無(wú)法檢測(cè)活的非可培養(yǎng)態(tài)細(xì)菌^[1]。如何準(zhǔn)確、快速、有效地對(duì)不同環(huán)境介質(zhì)中微生物進(jìn)行鑒定與監(jiān)測(cè)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本文綜述目前環(huán)境領(lǐng)域的微生物鑒定與監(jiān)測(cè)技術(shù)，對(duì)不同方法進(jìn)行比較分析，旨在分析各種方法的利弊，為有效獲取微生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：環(huán)境;微生物;鑒定;監(jiān)測(cè)

中圖分類號(hào)：Q938?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1671-2064（2019）16-0000-00

1 微生物定性定量分析

用于微生物定性定量分析方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、熒光定量PCR（qPCR）、數(shù)字PCR（dPCR）和熒光原位雜交（FISH）等。

1.1 PCR

常規(guī)的PCR主要是基于溫度變化時(shí)DNA鏈“變性-復(fù)性-延伸”的原理，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物，對(duì)目標(biāo)微生物的特征基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，從而判定樣品中是否含有某類微生物及其濃度。PCR擴(kuò)增的終產(chǎn)物可根據(jù)后續(xù)電泳條帶位置和亮度進(jìn)行定性和半定量分析。

1.2 qPCR

熒光定量PCR技術(shù)在PCR體系中加入熒光探針或熒光染料，利用熒光信號(hào)變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中每一輪循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行相對(duì)和絕對(duì)定量。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量分析。Knappik等比較細(xì)菌培養(yǎng)法和qPCR等方法在檢測(cè)老撾土壤和水體中類鼻疽伯克霍爾德桿菌的差異^[2]。結(jié)果表明對(duì)于土壤和水體樣品，經(jīng)富集培養(yǎng)后使用qPCR法的樣品陽(yáng)性檢出率顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)法和單獨(dú)qPCR法。

1.3 dPCR

qPCR依賴擴(kuò)增曲線Ct值定量，受不同樣品間擴(kuò)增效率影響較大，而dPCR不依賴于Ct值即可進(jìn)行定量。原理是將DNA樣本溶液隨機(jī)分配到大量獨(dú)立反應(yīng)單元，在每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)泊松公式通過(guò)統(tǒng)計(jì)反應(yīng)單元熒光信號(hào)來(lái)定量DNA。Doi等比較使用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和qPCR技術(shù)檢測(cè)池塘中侵入性藍(lán)鰓太陽(yáng)魚的環(huán)境DNA（eDNA）^[3]。表明使用ddPCR比qPCR有更高的檢出率，ddPCR對(duì)水體中存在的有機(jī)質(zhì)PCR抑制物有更好的抵抗性能，在eDNA檢測(cè)方面比熒光定量PCR更具優(yōu)勢(shì)。

1.4 FISH

FISH利用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記的DNA或RNA序列作為探針，按照堿基互補(bǔ)原則，與待測(cè)樣品的DNA或RNA進(jìn)行特異性結(jié)合，再通過(guò)熒光顯微鏡等觀察研究微生物特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位^[4]。FISH具有快速、可原位和定量分析等優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)菌普遍存在的自發(fā)熒光現(xiàn)象可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果^[5]。

2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法較多，比較常見(jiàn)的有傳統(tǒng)變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性酶切片長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）等方法。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)（High Thoughput Sequencing）迅猛發(fā)展，逐漸成為微生物群落結(jié)構(gòu)分析的主要研究手段。

2.1 DGGE

DGGE技術(shù)是在普通凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的DNA分離技術(shù)，最早由Lerman等提出^[6]。主要原理是堿基序列存在差異的DNA在含不同濃度變性劑的聚變稀酰胺凝膠中解鏈行為不同，根據(jù)電泳遷移速率的變化，可以將片段大小完全相同、僅堿基組成不同的DNA片段分開。經(jīng)DGGE變性分離的DNA條帶割膠回收后可以進(jìn)行圖譜聚類分析或序列分析^[7]。在微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析研究中，普遍采用PCR-DGGE是先將提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再進(jìn)行DGGE分離、測(cè)序。DGGE也存在如下缺點(diǎn)：

1. 實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，摸索最適實(shí)驗(yàn)條件耗時(shí)較長(zhǎng);
2. 由于16SrDNA不同拷貝之間的多態(tài)性，易導(dǎo)致對(duì)種群細(xì)菌豐度的高估;
3. 只有占群落細(xì)菌數(shù)量一定比例的類群才能被DGGE檢測(cè);
4. 對(duì)DGGE條帶中微生物分類鑒定還需要進(jìn)行條帶切割、PCR擴(kuò)增、分子克隆并測(cè)序，由于分辨率低，所割取的亮帶常包含兩種以上微生物^[8]。

2.2 T-RFLP

利用T-RFLP技術(shù)分析微生物群落，首先確定目標(biāo)DNA片段，根據(jù)目標(biāo)基因上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中一個(gè)引物的5末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記。然后提取待測(cè)樣品總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物的一端帶有這種熒光標(biāo)記物。再利用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得長(zhǎng)短不一的限制性片段（T-RFs），通過(guò)DNA測(cè)序儀對(duì)末端帶有熒光標(biāo)記物的片段進(jìn)行檢測(cè)。由于核苷酸序列具有多態(tài)性，不同長(zhǎng)度的末端限制性片段可代表不同的微生物，而相同長(zhǎng)度的末端限制性片段則代表至少一種微生物的存在，因此T-RFLP技術(shù)可以用來(lái)反映微生物菌落組成的情況^[9]。T-RFLP技術(shù)具有分辨率高、簡(jiǎn)單快速、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn)。但T-RFLP實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響因素眾多，樣品總DNA提取、PCR條件優(yōu)化以及限制性內(nèi)切酶的選擇均對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響^[10]。此外，T-RFLP圖譜中每個(gè)T-RFs可能不止對(duì)應(yīng)一個(gè)菌種，易造成對(duì)細(xì)菌種群多樣性的低估^[11]。

儲(chǔ)昭瑞等通過(guò)對(duì)SILVA（R108） SSU Ref數(shù)據(jù)庫(kù)中400條厭氧氨氧化菌16S rRNA基因序列的分析^[12]，建立了厭氧氨氧化菌特異性T-RFLP方法。該方法能夠有效、穩(wěn)定地應(yīng)用于環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌群落組成的快速分析。Aida等使用T-RFLP和高通量測(cè)序技術(shù)在上升流厭氧污泥床反應(yīng)器處理城市污水過(guò)程中研究厭氧硫氧化和微生物多樣性的關(guān)系^[13]。

2.3 高通量測(cè)序

最早的第一代測(cè)序（First Generation Sequencing， FGS）技術(shù)由Wu等提出^[14-16]。Margulies等在Nature發(fā)表“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors”一文^[17]，標(biāo)志著高通量測(cè)序技術(shù)時(shí)代的到來(lái)。又稱第二代測(cè)序（NGS）技術(shù)，該技術(shù)一次可對(duì)上百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，通量高，信息量大。

目前高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代（TGS）。最大特點(diǎn)是單分子測(cè)序技術(shù)（SMS），測(cè)序無(wú)需經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增過(guò)程。Harrs等在Science首次報(bào)道他們開發(fā)的真正單分子測(cè)序技術(shù)（TSMS）^[18]，原理是在隨機(jī)打斷的待測(cè)DNA樣品片段末端添加poly（A），然后與檢測(cè)芯片的poly（T）雜交、定位，并逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子，洗滌、采集熒光信號(hào)后，切開熒光染料和抑制基團(tuán)，再洗滌、加帽，摻入下一個(gè)核苷酸，進(jìn)行下一輪反應(yīng)，最終獲得完整的序列信息。其后，Pacific Biosciences 公司推出了單分子實(shí)時(shí)技術(shù)（SMRT），該方法在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)物，其測(cè)序速度快，并且具有讀數(shù)超長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)^[19]。目前關(guān)于高通量測(cè)序技術(shù)的研究層出不窮，如何降低測(cè)序成本，快速對(duì)海量測(cè)序數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析是今后的研究重點(diǎn)。

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收稿日期：2019-06-26

作者簡(jiǎn)介：吳根英（1986—），女，浙江龍泉人，碩士，工程師，研究方向：環(huán)境保護(hù)。