葛路路，石 雁，朱靜靜，李艷娟，馬東波，王 靜，吳秋歌

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 河南新鄉(xiāng) 453000

癌癥是全世界主要的公共衛(wèi)生問題，肺癌位居癌癥相關(guān)性死亡原因之首，預(yù)后差，其5 a生存率約為18%[1]，其中非小細胞肺癌約占肺癌的85%，大部分患者在確診時已屬中晚期，喪失了手術(shù)機會[2]。以順鉑為主的一線化療方案是非小細胞肺癌的主要治療手段，順鉑化療耐藥的出現(xiàn)是治療失敗的關(guān)鍵原因[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框C1(forkhead box C1，F(xiàn)OXC1)是叉頭框超家族的一個重要成員，參與胚胎的正常發(fā)育和器官形成的調(diào)節(jié)，越來越多的研究[4-6]指出，F(xiàn)OXC1不僅與鼻咽癌、口腔癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還能促進癌細胞的增殖、遷移、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)FOXC1過表達可誘導(dǎo)散發(fā)性三陰性乳腺癌對蒽環(huán)類化療藥物的耐藥。本研究通過向肺癌A549細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA，觀察細胞對順鉑敏感性的變化及細胞內(nèi)Bcl-2、Bax、FOXC1蛋白及mRNA表達的變化，以期為改善非小細胞肺癌化療耐藥、提高治療效果提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器A549細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；兔抗人FOXC1多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG-HRP二抗購自上海生工生物工程有限公司；FOXC1陰性對照(NC siRNA)、FOXC1 siRNA合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；BCA定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)取6孔板，將對數(shù)生長期的A549細胞按8×104個/孔進行接種，放置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.3不同濃度順鉑作用下細胞增殖活性檢測待細胞貼壁生長融合度達60%～70%，分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和FOXC1 siRNA。轉(zhuǎn)染操作嚴格按照說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后分別加入0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 nmol/L順鉑繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收獲細胞，嚴格按照CCK-8檢測試劑盒說明書操作檢測細胞增殖情況。細胞增殖抑制率=1-[藥物處理組A(570 nm)-調(diào)零孔A(570 nm)]/(對照組處理組A(570 nm)-調(diào)零孔A(570 nm)×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.4細胞分組取對數(shù)生長期細胞，當細胞融合度達60%～70%時分組處理：空白對照組(不做處理)、轉(zhuǎn)染試劑組(僅給予轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000)、NC siRNA轉(zhuǎn)染組、NC siRNA+順鉑組、FOXC1 siRNA組、FOXC1 siRNA+順鉑組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，順鉑濃度和作用時間取4 nmol/L和24 h。

1.5各組細胞凋亡檢測按照1.4分組并收集培養(yǎng)細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入Binding buffer制成1×106個/mL細胞懸液，每組取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin V-FITV和5 μL PI，室溫避光孵育15 min。使用BD LSRFTM流式細胞儀在30 min內(nèi)檢測，計算早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率。

1.6各組細胞中FOXC1、Bcl-2和Bax mRNA表達的qRT-PCR檢測按照1.4分組培養(yǎng)并收集細胞，依據(jù)RNA抽提試劑盒說明提取總RNA，所有步驟嚴格按照說明書進行。FOXC1、Bcl-2和Bax引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析各組mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.7各組細胞中FOXC1、Bcl-2和Bax 蛋白表達的Western blot檢測按照1.4分組培養(yǎng)并收集細胞，離心后加入細胞裂解液提取蛋白樣品，采用BCA法進行蛋白定量。取蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1體積比混勻，煮沸變性。通過SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，置入含50 g/L脫脂奶粉的封閉液(用1×TBST配制)中室溫封存1～2 h，分別加入兔抗人FOXC1多克隆抗體(按1∶1 000稀釋)，兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體(均按1∶2 000稀釋)，4 ℃過夜；次日復(fù)溫，30 min后TBST洗滌3次，5 min/次；后加入稀釋的二抗(按1∶5 000稀釋)室溫孵育1～2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL化學(xué)法顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)及Image J軟件分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA對順鉑作用下A549細胞增殖抑制率、細胞凋亡的影響以及相關(guān)蛋白及mRNA的相對表達量的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染FOXC1siRNA依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果組對順鉑作用下A549細胞增殖抑制率的影響見表2。由表2可知，在各濃度順鉑作用實驗條件下，與轉(zhuǎn)染NC siRNA的A549細胞相比，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA均表現(xiàn)出增強細胞增殖抑制率的效果(P<0.05)；進一步將NC siRNA+順鉑組中的IC50[(4.66±0.58)nmol/L]與FOXC1 siRNA+順鉑組中的IC50[(2.08±0.69)nmol/L]比較，發(fā)現(xiàn)抑制FOXC1表達后A549對順鉑藥物敏感性顯著提高(P<0.05)。

表2 順鉑作用下A549細胞增殖抑制率(n=3)

2.2各組A549細胞凋亡的比較見表3。由表3可知，與其他組相比，F(xiàn)OXC1 siRNA+順鉑組A549細胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率明顯提高。

表3 各組細胞凋亡率的比較(n=3)

△:與A、B、C組相比，P<0.05；*:與A、B、C、D組相比，P<0.05； #:與其他5組相比，P<0.05

2.3各組A549細胞中FOXC1、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達的比較見圖1和表4。與其他組相比，F(xiàn)OXC1 siRNA+順鉑組A549細胞中FOXC1和Bcl-2 mRNA及其蛋白的相對表達量下降，而Bax mRNA及其蛋白的相對表達量上升。

1:空白對照組;2：轉(zhuǎn)染試劑組;3：NC siRNA組;4：NC siRNA+順鉑組;5:FOXC1 siRNA組;6：FOXC1 siRNA+順鉑組

圖1各組A549細胞中FOXC1、Bcl-2和Bax蛋白的表達

表4 各組細胞FOXC1、Bcl-2和Bax表達的比較(n=3)

△:與A、B、C組相比，P<0.05;*:與A、B、C、D組相比，P<0.05;#:與其他5組相比，P<0.05

3 討論

盡管目前靶向抗癌治療和免疫治療方法激增，但順鉑仍是治療肺癌最廣泛使用的一線化療藥物[8]，臨床化療耐藥性被認為是晚期非小細胞肺癌患者治療失敗的主要原因[9-10]，并且可能受到多種因素的交互影響[11]。

FOX家族是一類成員眾多的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXC1編碼基因在人類中定位于6q25，基因全長3 500 bp，僅含1個外顯子，長為1 662 bp，F(xiàn)OXC1蛋白含553個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為56 700[12]。既往研究[13]表明FOXC1在NSCLC組織中表達明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。Chen等[14]的研究表明，F(xiàn)OXC1 siRNA能有效地沉默F(xiàn)OXC1在NSCLC細胞中的表達，并有可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑來增強腫瘤細胞的侵襲和遷移。此外，F(xiàn)OXC1還與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)，下調(diào)FOXC1表達有助于促進腫瘤細胞的凋亡[15-16]。FOXC1還可以作為乳腺癌常規(guī)化療藥物(如5-氟尿嘧啶、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、多西紫杉醇等)耐藥的調(diào)節(jié)器，F(xiàn)OXC1表達增加可明顯導(dǎo)致乳腺癌MDA-MB-468細胞對FEC化療方案耐藥，但是，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1在乳腺癌MA-MB-231細胞中的表達可提高對多西紫杉醇化療的敏感性[17]。

本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1在A549細胞中的表達；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA后可明顯增強A549細胞對順鉑的敏感性；且FOXC1 siRNA+順鉑組細胞凋亡率顯著高于其他組。因此，F(xiàn)OXC1的表達對A549細胞的順鉑耐藥性具有顯著性影響。此外，本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA在降低FOXC1表達的同時，可促進凋亡抑制因子Bcl-2表達的下降和凋亡促進因子Bax表達的升高。Bcl-2和Bax分別是最具代表性的抑制凋亡和促進凋亡因子，其表達與調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵途徑[18]。因此，抑制FOXC1的表達可能通過上調(diào)促進凋亡因子Bax的表達、下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達來促進腫瘤細胞的凋亡，提高A549細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，通過轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1的表達，可明顯提高A549細胞對順鉑的化療敏感性，促進細胞凋亡抑制因子Bcl-2表達的下降和凋亡促進因子Bax表達的升高。該研究結(jié)果可為后續(xù)提高A549細胞對化療藥物的敏感性研究，改善現(xiàn)有治療策略提供參考。