史志丹，宋培玲，郝麗芬，皇甫海燕，燕孟嬌，楊永青，郭 晨，賈曉清，皇甫九茹，李子欽，張寶輝，陳斐斐

（1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)特泥河農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古 特泥河 021024）

病原菌侵染寄主植物從可侵染部位的接觸開(kāi)始，到在寄主體內(nèi)定殖、擴(kuò)展、進(jìn)而使寄主表現(xiàn)病癥，在這個(gè)過(guò)程中植物個(gè)體也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗病或感病反應(yīng)，并且在生理、組織和形態(tài)上產(chǎn)生一系列的變化。一種寄生物能否成為某種植物的病原菌，取決于病原菌能否克服寄主的抗病機(jī)制，如能克服，則病原菌有致病性，寄主植物表現(xiàn)感病，兩者之間具有親和互作關(guān)系。如不能克服，病原菌沒(méi)有致病性，寄主植物表現(xiàn)抗病，兩者之間具有非親和性互作關(guān)系。寄主植物與病原菌之間具有非常復(fù)雜的相互作用，涉及植物與病原菌之間的識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)及植物防衛(wèi)反應(yīng)激活等事件[1]。因此，研究植物與病原菌的識(shí)別方式、親和性或非親和性的互作模式，對(duì)揭示植物與病原菌的互作機(jī)制具有重要意義[2]。借助分子標(biāo)記方法，可以示蹤病原菌在寄主中的入侵、定殖和繁殖過(guò)程。標(biāo)記病原微生物的方法主要有抗生素抗性基因、lacZ 基因、lux 基因、inaZ 基因、xylE 基因、gus 基因以及gfp 基因[3]。目前，在病原菌與寄主互作的研究中，利用綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記病原菌，對(duì)其侵染過(guò)程進(jìn)行示蹤是最為有效的細(xì)胞學(xué)方法之一[4]。GFP 作為重要報(bào)告基因，具有高靈敏度、穩(wěn)定性好、低細(xì)胞毒害性等特點(diǎn)。1962年，SHIMOMURA 等[5]首次在維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)GFP，直到1992年P(guān)RASHER 等[6]克隆出GFP的cDNA 全長(zhǎng)后，緊接著在1994年CHALFIE 等[7]在原核大腸桿菌和真核秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）中成功表達(dá)了具有熒光性的GFP，同時(shí)也證明了GFP 在水母中特異組分不存在的條件下熒光也可以正常表達(dá)。同年，HEIM 等[8]提出GFP 生色團(tuán)的發(fā)光機(jī)制，并表明了生色團(tuán)的形成不需要任何酶或輔助因子的參與。此后，GFP 成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，同時(shí)，GFP 作為一種新的報(bào)告分子或定位標(biāo)記物在多種細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到廣泛應(yīng)用，且修飾后GFP 也作為生物探針被應(yīng)用到試驗(yàn)中。

1 綠色熒光蛋白基因的病原菌轉(zhuǎn)化方法

1973年，MISHRA和TATUM對(duì)粗糙鏈孢霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得轉(zhuǎn)化子后，關(guān)于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究迅速發(fā)展起來(lái)。用于遺傳轉(zhuǎn)化方法有很多，針對(duì)原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法有CaCl2-PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，制備真菌原生質(zhì)體作為感受態(tài)細(xì)胞，在含有一定濃度的質(zhì)粒CaCl2-PEG 緩沖液中，利用電荷間的相互作用力在原生質(zhì)體表面與外源DNA 形成復(fù)合物，原生質(zhì)體通過(guò)內(nèi)吞作用將復(fù)合物整合在受體基因組中[9]。電擊轉(zhuǎn)化法是受體細(xì)胞在瞬間高電壓處理下，形成可恢復(fù)的局部電穿孔，使質(zhì)粒DNA 進(jìn)入受體細(xì)胞，在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常生理狀態(tài)從而獲得遺傳轉(zhuǎn)化子[10]。限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Restriction enzyme mediated integration，REMI）是將限制性?xún)?nèi)切酶與已經(jīng)線(xiàn)性化的質(zhì)粒在PEG的作用下導(dǎo)入受體細(xì)胞中，染色體DNA 被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)與線(xiàn)性質(zhì)粒連接，從而獲得轉(zhuǎn)化子[11]。針對(duì)完整細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化有基因槍轉(zhuǎn)化法，該方法利用高速微彈發(fā)射裝置，將外源DNA 包被在微小的金?；蜴u粒表面射入受體細(xì)胞中，使外源DNA表達(dá)[12]。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，是利用高濃度Li+或其他一價(jià)金屬陽(yáng)離子（Na+、K+、Rb+等）誘導(dǎo)并增強(qiáng)細(xì)胞滲透性，使其成為感受態(tài)，在PEG 協(xié)助下完成外源DNA的轉(zhuǎn)化[13]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法（ATMT），主要是通過(guò)農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒上的T-DNA 區(qū)和vir 區(qū)共同完成。T-DNA區(qū)是能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)宿主基因的區(qū)域，vir 區(qū)參與T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移以及整合，小分子酚類(lèi)和糖類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)激發(fā)會(huì)促使vir 區(qū)基因表達(dá)，農(nóng)桿菌侵染將T-DNA 轉(zhuǎn)移并整合至真菌基因組中[14]，使目的基因表達(dá)。不同的轉(zhuǎn)化方法在植物和病原菌中皆有應(yīng)用。陳孝仁等[15]利用CaCl2-PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法用GFP首次標(biāo)記了大豆疫霉，觀(guān)察了大豆疫霉在大豆上的侵染動(dòng)態(tài)并利用此報(bào)告系統(tǒng)顯微觀(guān)察了在抗病和感病大豆品種根部大豆疫霉游動(dòng)孢子的侵染情況，從細(xì)胞水平上了解了大豆的抗疫病機(jī)制。宿景霞[16]采用電擊轉(zhuǎn)化方法，將含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入溶磷細(xì)菌菌株中觀(guān)察其在葡萄根際的存活特征和定殖動(dòng)態(tài)規(guī)律。張?chǎng)蔚萚17]利用REMI 轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae）轉(zhuǎn)化子庫(kù)?；驑尫ê痛姿徜嚪ㄔ谡婢系膱?bào)道較少[18]。GU 等[19]利用基因槍法研究植物病原真菌分泌蛋白Ps87。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法首次在釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）的轉(zhuǎn)化中獲得成功，隨后在鬼傘菌（Coprinus lagopus）和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）等真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中也獲得成功[20]。趙鳳軒[21]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的真菌表達(dá)載體pCH-sGFP 導(dǎo)入到大麗輪枝菌中，研究了轉(zhuǎn)化子在不同抗病類(lèi)型棉種中侵染過(guò)程的差異，此方法在真菌研究中得到了廣泛的應(yīng)用，根據(jù)轉(zhuǎn)化對(duì)象的不同使用不同的轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化效率也不相同。

2 綠色熒光蛋白在病原菌侵染過(guò)程中的應(yīng)用

綠色熒光蛋白具有多種優(yōu)點(diǎn)使其在研究病原菌侵染過(guò)程中廣泛應(yīng)用。GFP對(duì)受體細(xì)胞低毒害性，不會(huì)影響受體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能，在紫外光或藍(lán)光的照射激發(fā)下便可觀(guān)察到綠色熒光，熒光穩(wěn)定有較強(qiáng)的耐受性，可以方便、快捷地進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[22]。熒光蛋白標(biāo)記病原菌后，篩選出熒光蛋白穩(wěn)定表達(dá)和致病力無(wú)明顯差異的轉(zhuǎn)化子可以接種于不同生育期和不同組織的寄主植物，在不同時(shí)間點(diǎn)、不同的組織部位取樣通過(guò)熒光或共聚焦顯微鏡直觀(guān)地觀(guān)察侵染部位的病原菌。自1996年SPELLIG 等成功轉(zhuǎn)化了玉米黑粉菌，隨后GFP 被應(yīng)用在多個(gè)種屬的真菌中。SEXTON 等[23]將gfp 基因?qū)牒诿劜。↙eptosphaeria maculans）中，觀(guān)察其侵染油菜的過(guò)程。陶愷[24]通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株的獲得，揭示了大豆疫霉與寄主親和、非親和互作的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。賈娜娜[22]利用ATMT 技術(shù)對(duì)梨腐爛病菌進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記，獲得了梨腐爛病菌轉(zhuǎn)化子，并用篩選到的強(qiáng)、弱致病力菌株轉(zhuǎn)化子侵染梨樹(shù)組織觀(guān)察病原菌在梨樹(shù)中的侵染過(guò)程。對(duì)獲得的病原菌轉(zhuǎn)化子利用分子技術(shù)擴(kuò)增獲得gfp 基因的兩翼序列，分析突變的目的基因及其功能，從而為研究病原菌的致病機(jī)理提供基礎(chǔ)[25]。張鍵[26]構(gòu)建了大麗輪枝菌的T-DNA 突變體庫(kù)，分析并研究了T-DNA 插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列以及突變基因的功能，發(fā)現(xiàn)敲除VdOCH1 基因能夠降低病原菌的致病性。姚錦愛(ài)等[27]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入到建蘭莖腐病原尖孢鐮刀菌F02 中，并獲得了表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)化子。孫洪寶等[28]利用綠色熒光蛋白作為標(biāo)記，明確了枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖動(dòng)態(tài)，從組織學(xué)的角度闡釋西瓜與枯萎病菌親和互作和非親和互作的差異。

3 綠色熒光蛋白在定量檢測(cè)植物組織中病原物數(shù)量的應(yīng)用

真菌與植物相互作用的研究中，通過(guò)研究受感染的宿主植物組織中病原菌生物量對(duì)于明確病害的進(jìn)展具有重要意義。目前的研究方法存在一定的局限性。對(duì)真菌生物量的定量常通過(guò)幾丁質(zhì)和麥角甾醇的含量來(lái)檢測(cè)。前者是細(xì)胞壁的組成成分，后者是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分。但是，這兩種物質(zhì)存在于多種真菌中，因此這種測(cè)定方法不具有物種特異性。病原菌生物量的定量也可以通過(guò)測(cè)定特定蛋白質(zhì)（DNA 或RNA）的量，但是，這兩種方法比較耗時(shí)，且提取出的RNA 容易降解。而綠色熒光蛋白作為一種高效標(biāo)記物有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其熒光強(qiáng)度和gfp的表達(dá)量成正比，MAOR 等[29]指出綠色熒光強(qiáng)度與異源金線(xiàn)菌轉(zhuǎn)化株的菌絲數(shù)量高度相關(guān)，因此可以通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度而定量真菌的生物量。CHEN 等[30]利用改良的GFP標(biāo)記大豆炭疽（Colletotrichum destructivum）和西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare），測(cè)定其接種葉片中綠色熒光蛋白的積累量，同時(shí)與Northern blot 雜交技術(shù)測(cè)定真菌肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)量做對(duì)比，結(jié)果表明，熒光量與真菌生長(zhǎng)密切相關(guān)，利用GFP標(biāo)記的真菌檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度是一種準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便的方法，可以定量寄主植物細(xì)胞內(nèi)真菌的生長(zhǎng)[31]。

4 綠色熒光蛋白在病原菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位中的應(yīng)用

GFP作為一個(gè)分子標(biāo)記可以在細(xì)胞的任何區(qū)域進(jìn)行定位，因此，GFP 在真菌亞細(xì)胞的研究和蛋白功能研究中廣泛運(yùn)用。構(gòu)建GFP 融合蛋白是亞細(xì)胞定位中的一種重要手段，亞細(xì)胞定位能明確表達(dá)蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞中出現(xiàn)的部位，將GFP與細(xì)胞器相關(guān)蛋白融合表達(dá)，就可以觀(guān)察候選蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜的分布，以及在不同階段的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，這對(duì)于研究真菌的有絲分裂、蛋白分泌、菌絲融合等過(guò)程具有重要作用[32]。RIEDEL 等[33]通過(guò)GFP標(biāo)記的橡樹(shù)疫霉菌（Phytophthora ramorum），研究其各個(gè)生活史階段營(yíng)養(yǎng)體的細(xì)胞學(xué)形態(tài)，與未標(biāo)記菌株相比，GFP菌株致病能力明顯變化。AUDREY 等[34]通過(guò)將青色熒光蛋白（CFP）、綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、紅色熒光蛋白（mCherry）與已知亞細(xì)胞定位的基因的N 端或C 端相連，構(gòu)建融合表達(dá)載體，對(duì)致病疫霉（Phytophthora infestans）體內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線(xiàn)粒體、細(xì)胞核以及過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器形態(tài)和分布進(jìn)行了研究。郭曉宇等[35]利用熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合熒光染色的方法來(lái)研究稻瘟病菌有性世代的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，清晰地標(biāo)記了子囊和子囊孢子的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器和存儲(chǔ)物質(zhì)。

5 展望

綠色熒光蛋白廣泛應(yīng)用于植物病害的各個(gè)方面，從植物病原菌的檢測(cè)、侵染定殖、抗病基因的表達(dá)、抗病轉(zhuǎn)基因植株的篩選及病原菌致病機(jī)理的研究到分子生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等方面的應(yīng)用，GFP 都具有其他報(bào)告基因不可替代的優(yōu)點(diǎn)。尤其是在研究病原菌與植物互作方面，能夠?qū)崟r(shí)明確病原菌的侵染過(guò)程。以上僅是GFP 眾多應(yīng)用中的一小部分，隨著GFP 工程的發(fā)展，GFP的應(yīng)用將會(huì)更加廣闊。