王 言，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，楊躍奎，陶 璇，鐘志君，陳曉輝，曾 凱，何志平，呂學(xué)斌（四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

微RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，在生物中普遍存在。大小只有19～24 個(gè)核苷酸，它們廣泛存在于多種真核生物體中，通過(guò)與靶mRNA 的3'UTR（非編碼區(qū)域）互補(bǔ)結(jié)合，可降解該mRNA 或抑制其翻譯，其在基因表達(dá)調(diào)控、生物個(gè)體發(fā)育、代謝、疾病發(fā)生和免疫調(diào)控等生理過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。miR-23a 以ZNF423 為靶基因，抑制牛胎兒骨骼肌來(lái)源的前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程[4]。miR-151-3p 通過(guò)ATP2a2 參與調(diào)控慢肌的發(fā)生發(fā)育過(guò)程[5]。Ana等研究發(fā)現(xiàn)miR-199a 能促進(jìn)成年小鼠心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，并且促進(jìn)新生小鼠和成年小鼠心肌細(xì)胞的增殖[6]。miR-299 是調(diào)控生肌調(diào)節(jié)因子Myf6 的候選miRNA，可正向調(diào)控C2C12 成肌細(xì)胞分化[7]。miR-497 參與心肌細(xì)胞的早期發(fā)育[8]，miR-497 表達(dá)量的提高是成肌分化的前提條件，并且miR-497 可能通過(guò)HMGA1-Id 通路調(diào)控成肌分化[9]。

豬是畜牧生產(chǎn)中重要的家畜，它作為人類(lèi)最重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)肉質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)健康的優(yōu)質(zhì)豬肉產(chǎn)品的需求量劇增。然而過(guò)去的幾十年間，對(duì)豬的遺傳改良主要集中在一味提高生長(zhǎng)速度和增加瘦肉率等生長(zhǎng)和胴體性狀方面，這也導(dǎo)致了豬肉品質(zhì)的急劇下降[10-11]，故在生產(chǎn)生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高的豬同時(shí)，兼顧到豬肉品質(zhì)好已成為目前豬育種界的研究熱點(diǎn)。藏豬、雅南豬、內(nèi)江豬和大約克夏豬在胴體和豬肉品質(zhì)上呈現(xiàn)巨大表型差異，使其成為肉質(zhì)相關(guān)研究的理想試驗(yàn)材料。鑒于上述miRNA 與調(diào)控肌肉與脂肪細(xì)胞分化過(guò)程有密切的關(guān)系，本研究以經(jīng)過(guò)高度人工選育的引進(jìn)豬種大約克夏豬、選育程度較低的地方豬種（雅南豬、內(nèi)江豬）以及四川省特有的高原型品種藏豬為研究對(duì)象，采用Q-PCR 技術(shù)對(duì)其背最長(zhǎng)肌組織中miR-23a、miR-151、miR-299、miR-199a 和miR-497 的表達(dá)與肉質(zhì)性狀的差異進(jìn)行了研究。該研究為闡明不同豬種肉質(zhì)差異形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，將為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬育種提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在四川省畜牧科學(xué)研究院養(yǎng)豬所科研基地進(jìn)行。選擇健康狀況良好、日齡相近的藏豬、雅南豬、內(nèi)江豬和大約克夏豬各3 頭，于2015 年12 月開(kāi)始組建群體，分圈飼養(yǎng)，并在相同條件下飼喂，試驗(yàn)期間所有豬自由采食飲水。所有試驗(yàn)豬達(dá)9 月齡時(shí)進(jìn)行屠宰，宰前空腹24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集左胴體倒數(shù)第3、4 肋骨間背最長(zhǎng)肌組織樣本，用于后續(xù)的肉質(zhì)表型指標(biāo)測(cè)定和RNA 提取。

2 試驗(yàn)方法

2.1 肉質(zhì)性狀表型指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定 利用全自動(dòng)索氏抽提儀（BUCHI 公司）測(cè)定豬背最長(zhǎng)肌中肌內(nèi)脂肪的含量。樣品處理和試驗(yàn)方法按照《肉與肉制品游離脂肪含量測(cè)定》（GB/T 9695.1—2008）進(jìn)行操作。

2.1.2 肌纖維面積的測(cè)定 利用冰凍切片法和HE染色法制作背最長(zhǎng)肌組織樣品的冰凍切片，通過(guò)顯微圖像分析軟件計(jì)算樣品的肌纖維直徑（面積）。

2.1.3 硫胺素含量的測(cè)定 樣本處理和試驗(yàn)方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中硫胺素（維生素B1）的測(cè)定》（GB/T 5009.84—2003）。

2.1.4 眼肌面積和瘦肉率的測(cè)定 測(cè)量左胴體倒數(shù)第3、4 肋間眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7 計(jì)算眼肌面積。按照《豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 825—2004）方法操作并計(jì)算瘦肉率。

2.2 qRT-PCR 檢測(cè)

2.2.1 肌肉組織中總RNA 的提取 組織RNA 抽提使用Qiagen 公司的miRNeasy Mini Kit 試劑盒，RNA抽提過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為保證RNA的質(zhì)量，抽提得到的RNA 采用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳和生物分析儀Agilent 2100 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)合格后，方可分別用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

2.2.2 qRT-PCR 的操作步驟 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)將RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA，在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad 公司生產(chǎn)）上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系（20 μL）：Sso－Fast EvaGreen 混合液10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物1 μL，RNA－free water（Ambion, USA）7 μL。5S、18S 和U6 作為miRNA 定量的內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。所有目的miRNA 定量結(jié)果均通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證PCR 產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無(wú)引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，每次檢測(cè)含3 個(gè)陰性對(duì)照。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 軟件對(duì)miRNA 相對(duì)表達(dá)量和肉質(zhì)表型指標(biāo)進(jìn)行Duncan 分析其差異顯著性，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Sigmaplot 12.0 中的Pearson Correlation 程序分析miRNA 相對(duì)表達(dá)量和表型指標(biāo)的相關(guān)性。

3 結(jié)果與分析

3.1 相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量

由表2 可知，在4 個(gè)豬種中，藏豬和內(nèi)江豬的肌內(nèi)脂肪含量最高（4.91%），其次為雅南豬（3.87%），約克夏豬最低（2.04%），3 個(gè)地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于外種豬（P＜0.05）；藏豬肌纖維面積最?。? 712.86 μm2），顯著或極顯著小于其他3個(gè)豬種（P＜0.05），約克夏豬肌纖維面積最大（6 703.31 μm2），極顯著大于藏豬和內(nèi)江豬（P＜0.01），顯著大于雅南豬（P＜0.05）；3 個(gè)地方豬種的眼肌面積在14～22 cm2之間，藏豬、雅南豬和內(nèi)江豬的眼肌面積均極顯著小于約克夏豬；3 個(gè)地方豬之間瘦肉率差異不顯著，約克夏豬瘦肉率最高（63.84%），極顯著高于3 個(gè)地方豬（P＜0.01）；雅南豬的硫胺素含量最高（2.79 μg/g），顯著高于其他3 個(gè)豬種（P＜0.05），其次是藏豬（1.94 μg/g），內(nèi)江豬和約克夏豬最低（1.11 μg/g），顯著低于雅南豬和藏豬（P＜0.05）。

3.2 5 種miRNA 在不同豬種中的表達(dá)水平

采用Q-PCR 的方法檢測(cè)了5 種miRNA 在豬背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，miR-23a 在藏豬中的相對(duì)表達(dá)量高于其他3 個(gè)豬種，但差異不顯著（P＞0.05）；miR-151 在藏豬中相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于雅南豬和大約克夏豬（P＜0.05），雅南豬的miR-151 相對(duì)表達(dá)量顯著高于約克夏豬（P＜0.05）；miR-199a 在約克夏豬中相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他3 個(gè)豬種（P＜0.05）；miR-299 在約克夏豬中相對(duì)表達(dá)量最高，在藏豬中相對(duì)表達(dá)量最低，約克夏豬的miR-299 相對(duì)表達(dá)量顯著高于藏豬和內(nèi)江豬（P＜0.05），雅南豬的miR-299 相對(duì)表達(dá)量顯著高于藏豬（P＜0.05）；miR-497 在約克夏豬中相對(duì)表達(dá)量最高，在內(nèi)江豬中最低，約克夏豬中的miR-497 表達(dá)水平顯著高于藏豬和內(nèi)江豬（P＜0.05），藏豬和雅南豬中的miR-497 表達(dá)水平顯著高于內(nèi)江豬（P＜0.05）。

表3 5 種miRNA 在不同豬種中的表達(dá)水平

3.3 5 種miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量的相關(guān)性

采用Sigmaplot 12.0 分析了肉質(zhì)形狀相關(guān)指標(biāo)和基因表達(dá)量的相關(guān)性。由表4 可知，miR-23a 和miR-151 在豬背最長(zhǎng)肌中表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素呈正相關(guān)，與肌纖維面積、眼肌面積、瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，其中miR-151 在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量、肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01）；miR-199a、miR-299 和miR-497 在豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪和硫胺素呈負(fù)相關(guān)，與肌纖維面積、眼肌面積、瘦肉率呈正相關(guān)，其中miR-199a 的表達(dá)水平與瘦肉率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），miR-299 的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與肌纖維面積呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），miR-497 的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與瘦肉率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表4 5 種miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量的相關(guān)性

4 討論

豬肉風(fēng)味品質(zhì)的形成是涉及多基因、多途徑和多階段的復(fù)雜生理生化過(guò)程[12]。肌內(nèi)脂肪含量越高，則肉的多汁性越好，所以肌內(nèi)脂肪含量是豬肉口感的決定性因素之一；本研究中的3 個(gè)地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量（IMF）顯著高于大約克夏豬，肉質(zhì)口感更好。肌纖維直徑越細(xì)，肉質(zhì)就越細(xì)嫩；本研究中3個(gè)地方豬種的肌纖維面積都小于約克夏豬，所以肉質(zhì)也較為細(xì)嫩。硫胺素是一種非常重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其熱降解是食品加工過(guò)程中風(fēng)味形成的主要途徑之一；本研究中藏豬和雅南豬肌肉中的硫胺素含量顯著高于內(nèi)江豬和約克夏豬，肉質(zhì)風(fēng)味更好。胴體瘦肉率是評(píng)價(jià)胴體品質(zhì)的主要指標(biāo)，與眼肌面積呈極顯著正相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，胴體瘦肉率過(guò)高會(huì)降低豬肉品質(zhì)。本研究中藏豬、雅南豬、內(nèi)江豬是四川省主要地方豬種資源，以耐粗飼，肉質(zhì)優(yōu)良，肌肉顏色鮮紅、系水力強(qiáng)、細(xì)嫩多汁、富含肌內(nèi)脂肪而著稱(chēng)，但其生長(zhǎng)速度慢，瘦肉率在43%～48%之間，飼料轉(zhuǎn)化率低，屬選育程度較低的豬種；而從國(guó)外引進(jìn)的大約克夏豬以高生長(zhǎng)速度、高瘦肉率（63.84%）而著稱(chēng)，但其肉質(zhì)相對(duì)較差，屬典型經(jīng)過(guò)高度選育的瘦肉型豬種。綜上所述，3 個(gè)地方豬種相對(duì)于大約克夏豬，均屬于肉質(zhì)優(yōu)良豬種，其肉質(zhì)口感多汁細(xì)膩、風(fēng)味較好，但瘦肉率較低，可作為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬的育種素材。

miRNA 對(duì)豬肌肉發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用。豬miR-23a 可靶向作用于Smad3 基因[13]，Smad3 可通過(guò)干擾MyoD 的活性和表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Myostatin 的信號(hào)通路，從而抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化[14]。miR-151在成肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的增殖階段表達(dá)量增加，而在分化階段表達(dá)量降低[5]。研究表明miR-199a 在肌肉發(fā)育過(guò)程中起重要作用[15]，在miR-199a/miR-214基因簇被敲除后背最長(zhǎng)肌發(fā)育受到影響[16]。Yap 是miR-299 的潛在靶基因，Yap 是hippo 通路的成員，在C2C12 細(xì)胞的分化、肌衛(wèi)星細(xì)胞命運(yùn)的決定、肌肉纖維類(lèi)型、肌肉萎縮等過(guò)程中有重要的作用[17-19]。miR-195/497 表達(dá)量的改變?cè)谛∈竽Ｐ秃统杉〖?xì)胞中影響Myogenin 的表達(dá)量，而鐘嘉勝[9]研究指出Myogenin 具有增加胴體瘦肉率和眼肌面積，減低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴體長(zhǎng)度等提高胴體肉品質(zhì)的效應(yīng)，另外Myogenin 同樣影響著肉質(zhì)的劣變。本研究中miRNA 相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示，miR-23a、miR-151 在3 個(gè)脂肪型豬種中的表達(dá)量均高于瘦肉型豬種大約克夏豬，而miR-199a、miR-299 和miR-497 在大約克夏豬中的相對(duì)表達(dá)量高于在3 個(gè)脂肪型豬種中的相對(duì)表達(dá)量；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-23a、miR-151 與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量呈正相關(guān)，與肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，而miR-199a、miR-299 和miR-497 與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量均呈負(fù)相關(guān)，與肌纖維面積、眼肌面積和瘦肉率呈正相關(guān)。這表明miR-23a、miR-151對(duì)豬肉品質(zhì)具有正向調(diào)控作用，對(duì)豬胴體性能具負(fù)向調(diào)控作用；miR-199a、miR-299 和miR-497 對(duì)豬肉品質(zhì)具有負(fù)向調(diào)控作用，對(duì)豬胴體性能具正向調(diào)控作用。

這5 種miRNA 與豬肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積密切相關(guān)，本研究結(jié)果可為闡明豬肉品質(zhì)形成的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為通過(guò)調(diào)控其表達(dá)水平從而改善豬肉質(zhì)和提高豬胴體性能提供了可能。