關(guān) 鵬，代小娟，秦培剛，宋金東，賀志有

(1. 渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，陜西 渭南 714026；2. 新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830011)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是在土壤、塵埃、植物表面、昆蟲尸體以及污水等介質(zhì)中廣泛存在的一種革蘭氏陽性細(xì)菌，由于其在芽胞形成過程中產(chǎn)生球形、立方體形、橢球形、菱形以及不規(guī)則形狀等伴胞晶體[1-3]，又稱殺蟲晶體蛋白，對(duì)多種農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲具有特異性殺蟲活性，而對(duì)人類及家畜無毒害，且不污染環(huán)境，因此成為全世界廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲劑之一。

隨著Bt菌株及其殺蟲功能基因在農(nóng)林和衛(wèi)生害蟲生物防治領(lǐng)域的大量應(yīng)用，害蟲耐藥性問題日益嚴(yán)重，生物防治效率顯著降低，因此，害蟲耐藥性問題已成為Bt資源應(yīng)用的一個(gè)瓶頸[4-5]。近些年來，廣大科研工作者通過不斷挖掘廣譜高效殺蟲活性的野生型Bt菌株[6]，克隆大量高毒力的Bt殺蟲基因[7-8]，以及通過不同Bt殺蟲基因進(jìn)行片段置換或共表達(dá)等分子生物學(xué)手段解決害蟲耐藥性問題[9-10]，提高Bt生物防治的效果，因此Bt菌株資源和殺蟲功能基因的研究成為Bt研究的熱點(diǎn)之一。

Bt SG3-7菌株是一株從秦嶺山區(qū)灌木叢土壤中分離的，能產(chǎn)生大量不規(guī)則伴胞晶體的野生菌株，本研究擬對(duì)該菌株的伴胞晶體形態(tài)、伴胞晶體編碼基因的類型以及殺蟲活性等方面進(jìn)行分析，為該菌株在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 野生型Bt SG3-7菌株是從秦嶺山區(qū)灌木叢土壤中分離得到并保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 測(cè)試?yán)ハx 甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)2齡期幼蟲通過本實(shí)驗(yàn)室人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)；菜青蟲(Pierisrapae)2齡期幼蟲通過新鮮甘藍(lán)喂養(yǎng)。

1.1.3 培養(yǎng)基 1/2LB、LB固體和液體培養(yǎng)基配置方法參見文獻(xiàn)[11]。

1.2 方法

1.2.1 Bt SG3-7菌株的活化及培養(yǎng) 吸取10 μL-20 °C保存的SG3-7菌株，接種在100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 °C，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10～12 h，然后吸取2 mL培養(yǎng)液，按1:100比例轉(zhuǎn)接入1/2 LB液體培養(yǎng)基中，在30 °C，180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48～72 h，最后離心收集胞晶混合物。

1.2.2 Bt SG3-7菌株顯微觀察 取少量上述胞晶混合物先后用預(yù)冷的1 mol·L-1NaCl洗滌3次，預(yù)冷的無菌水洗滌2次，最后加入適量預(yù)冷的無菌水制成懸液。吸取2-3 μL懸液在載玻片上涂布均勻，經(jīng)染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，最后對(duì)懸液中胞晶混合物進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.3 Bt SG3-7菌株中伴胞晶體蛋白的電泳分析 上述懸液經(jīng)超聲波破碎后，離心獲得細(xì)胞裂解物，采用Sch?gger 等人方法對(duì)Bt SG3-7菌株中伴胞晶體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析[12]。

1.2.4 Bt SG3-7菌株質(zhì)粒DNA提取及殺蟲基因型鑒定 參考關(guān)鵬等人方法對(duì)Bt SG3-7菌株中質(zhì)粒DNA進(jìn)行提取[11]。以該質(zhì)粒DNA為PCR擴(kuò)增模板，利用PCR-RFLP方法對(duì)該菌株中伴胞晶體蛋白編碼基因的類型進(jìn)行鑒定，引物序列參見文獻(xiàn)[13-14]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)與pMD19-T克隆載體連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，對(duì)陽性單克隆進(jìn)行測(cè)序分析。運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫中 Blast工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 Bt SG3-7菌株的殺蟲活性分析 將制備好的Bt SG3-7菌株胞晶混合物先用預(yù)冷的1 mol·L-1NaCl洗滌3次，再用預(yù)冷的無菌水洗滌一次，最后胞晶混合物經(jīng)稱重后，加入10 mL無菌水后震蕩混勻，通過梯度稀釋制成10～100 μg·mL-1等 6個(gè)不同濃度的測(cè)試樣品組。對(duì)棉鈴蟲、甜菜夜蛾幼蟲生物活性測(cè)定的方法參見文獻(xiàn)[11]。對(duì)菜青蟲幼蟲的生物活性測(cè)定：選取新鮮的甘藍(lán)制成大小相同的小塊，然后分別均勻地浸泡在不同的測(cè)試樣品中，然后取出，陰干，放入滅菌的培養(yǎng)皿中[15]。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入2頭幼蟲，每個(gè)測(cè)試樣品組做3個(gè)重復(fù)，以無菌水浸泡的甘藍(lán)作為陰性對(duì)照。室溫培養(yǎng)3～5 d，然后統(tǒng)計(jì)結(jié)果并用SPSS10.0軟件分析計(jì)算LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt SG3-7菌株的芽胞及伴胞晶體形態(tài)觀察

通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，Bt SG3-7菌株在1/2 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，有大量不規(guī)則形狀的伴胞晶體及橢圓狀芽胞產(chǎn)生，且芽胞與晶體呈分離狀態(tài)。(圖1-A，圖1-B)。

圖1 BtSG3-7菌株芽胞和伴胞晶體的顯微觀察

A：Bt SG3-7芽胞和伴胞晶體的光學(xué)顯微鏡觀察；B：Bt SG3-7芽胞和伴胞晶體的掃描電鏡觀察；P：伴孢晶體；S：芽胞。

2.2 Bt SG3-7菌株的伴胞晶體蛋白的電泳分析

SDS-PAGE電泳分析表明，Bt SG3-7菌株主要表達(dá)130 kDa和60 kDa分子量大小的伴胞晶體蛋白(圖2)。

圖2 BtSG3-7菌株伴胞晶體蛋白的SDS-PAGE電泳分析

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. Bt SG3-7菌株表達(dá)的伴胞晶體蛋白。

2.3 Bt SG3-7菌株的伴胞晶體蛋白編碼基因的類型分析

采用PCR-RFLP方法對(duì)Bt SG3-7菌株的伴胞晶體蛋白編碼基因的類型分析表明，該菌株質(zhì)粒DNA中攜帶cry2Ab、cry4A、cry9Ea等3個(gè)cry基因片段，以及1個(gè)cyt1Aa型基因片段。

2.4 Bt SG3-7菌株的殺蟲活性分析

Bt SG3-7菌株的胞晶混合物對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、甜菜夜蛾和菜青蟲幼蟲的殺蟲活性分析表明，該菌株對(duì)甜菜夜蛾和菜青蟲幼蟲具有較高殺蟲活性，其LC50分別為29.31 μg·mL-1和47.11 μg·mL-1，但對(duì)棉鈴蟲幼蟲無殺蟲活性(見表1)。

表1 BtSG3-7菌株胞晶混合物對(duì)三種鱗翅目害蟲的殺蟲活性測(cè)定

N：無殺蟲活性。

3 討論

經(jīng)PCR-RFLP方法鑒定Bt SG3-7菌株內(nèi)生質(zhì)粒中攜帶有cry2Ab、cry4A、cry9Ea、 cyt1Aa型殺蟲晶體蛋白基因。根據(jù)以前的研究報(bào)道，cry2Ab基因表達(dá)約70 kDa分子量大小的蛋白，對(duì)鱗翅目的小菜蛾(Plutellaxylostella)、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)等幼蟲有顯著殺蟲活性[16-17]。cry9Ea型基因編碼分子量約為130 kDa的蛋白，對(duì)粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、小菜蛾等鱗翅目幼蟲具有特異性殺蟲活性[18-19]。cry4A 和cyt1Aa型基因分別編碼135 kDa和27 kDa的殺蟲蛋白，兩者均對(duì)雙翅目的蚊蟲具有特異性殺蟲活性[20-21]。SDS-PAGE電泳分析表明，Bt SG3-7菌株主要表達(dá)130 kDa和60 kDa伴胞晶體蛋白，因此，可推測(cè)Bt SG3-7菌株的伴胞晶體可能由多個(gè)Cry蛋白混合形成，其次，cry2Ab和cyt1Aa型基因在該菌株中表達(dá)量極低，或者該菌株中攜帶的這兩個(gè)基因可能不完整而未表達(dá)。另外，在Bt SG3-7菌株中鑒定得到的殺蟲基因均不表達(dá)60 kDa伴胞晶體蛋白，因此這表明該菌株中可能含有其他新型殺蟲基因未被鑒定。

鱗翅目的甜菜夜蛾和菜青蟲對(duì)農(nóng)業(yè)中多種蔬菜危害嚴(yán)重，而人們一直采用高毒性的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)這些害蟲進(jìn)行防治，其結(jié)果造成環(huán)境污染，蔬菜農(nóng)藥殘留，以及害蟲耐藥性的產(chǎn)生，這不僅威脅到人類的健康，而且大大增加的害蟲防治的成本。本研究中Bt SG3-7菌株對(duì)甜菜夜蛾和菜青蟲幼蟲具有特異性殺蟲活性，因此該菌株可作為備用Bt菌株資源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對(duì)甜菜夜蛾和菜青蟲害蟲特異性生物防治中應(yīng)用。

在后續(xù)的研究中，將對(duì)Bt SG3-7菌株中這些殺蟲基因進(jìn)行克隆和表達(dá)研究，明確其殺蟲活性。另外，采用其他方法對(duì)該菌株中其他新的殺蟲基因進(jìn)行鑒定和克隆，為該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。