賈傳釗， 李香真， 肖洪文， 章 淼，

(1.中國核動力研究設(shè)計院， 成都 610041； 2.中國科學(xué)院成都生物研究所，中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室， 環(huán)境微生物四川省重點實驗室， 成都 610041)

厭氧發(fā)酵可在處理有機(jī)廢棄物的同時產(chǎn)生甲烷氣體[1]。發(fā)酵系統(tǒng)中的氨氮主要來自于發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)、氨基酸以及尿素等的水解[2]，能被微生物直接利用并對發(fā)酵系統(tǒng)具有緩沖作用[3]。適宜的氨氮濃度對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和穩(wěn)定性的維持具有促進(jìn)作用。但高氨氮也會對發(fā)酵過程產(chǎn)生不利影響[4]，主要是通過對發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)和活性的影響，從而影響整個反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。由于產(chǎn)甲烷古菌比水解酸化細(xì)菌對氨氮更加敏感[5-6]，因此，高氨氮對產(chǎn)甲烷古菌會產(chǎn)生更顯著的影響。前期的一些研究揭示了厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)[7]，但對微生物活性以及相關(guān)的代謝過程研究較少。

轉(zhuǎn)錄組信息能夠有效幫助研究特定時間與特定環(huán)境條件下活性微生物的基因表達(dá)水平，準(zhǔn)確預(yù)測不同環(huán)境條件下起作用的微生物[8-10]。并且隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序中存在的一些問題逐步得到解決[11]。目前微生物轉(zhuǎn)錄組已在動物腸道微生物、土壤、淤泥等方面得到了廣泛的應(yīng)用[12-13]。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序不僅能夠使我們更好地理解反應(yīng)系統(tǒng)對外界環(huán)境因子沖擊的響應(yīng)，也可利用分析得到的結(jié)果對反應(yīng)系統(tǒng)的環(huán)境參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，使反應(yīng)系統(tǒng)具有更好的穩(wěn)定性。

在本研究之前，基于IlluminaMiseq高通量測序技術(shù)，已經(jīng)完成了不同氨氮濃度條件下厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[14]。本研究主要目的是考察高氨氮濃度(>5000 mg·L-1)條件下起作用的活性微生物群落，以及高氨氮對產(chǎn)甲烷古菌的影響。

1 材料與方法

1.1 厭氧反應(yīng)器的建立與樣品采集

厭氧反應(yīng)器的建立與之前的試驗相同[14]，采用總固體含量為6%的豬糞作為厭氧發(fā)酵底物，在pH值為7.0±0.1，溫度為35℃±2℃，水力停留時間為8天的條件下運行。選取起始氨氮濃度為1000 mg·L-1(對照組發(fā)酵液中氨氮的初始含量)，5500 mg·L-1和7000 mg·L-1的反應(yīng)器進(jìn)行研究，并將不同氨氮濃度的反應(yīng)器分別命名為R1，R2和R3。在發(fā)酵第21天采集發(fā)酵液重復(fù)樣品(3個)，于12000 rpm離心收集沉淀部分，并冷凍于-80℃以備RNA的提取。

1.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及16S rRNA基因擴(kuò)增

將0.3 g固體樣品與玻璃珠置于同一個容器中，通過振蕩釋放樣品中的核酸。樣品中RNA的提取采用細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(Cat.No.DP430;TIANGEN,China)，按照試劑盒所提供的方法和步驟，使得RNA分離與純化。得到的RNA采用凝膠電泳和Nanodrop分光光度計進(jìn)行質(zhì)量檢驗(Nanodrop 2000c;Thermo Scientific, USA)。隨后，以總RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下生成cDNA的第一條鏈，再在DNA聚合酶等作用下生成cDNA的第二條鏈。這一過程采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒實現(xiàn)。使用細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增[15]，擴(kuò)增條件為：在94℃條件下高溫變性3分鐘，后進(jìn)行30次中溫循環(huán)，中溫循環(huán)在94℃條件下持續(xù)30 s，56℃條件下持續(xù)30 s，在72℃條件下持續(xù)40 s，最后在72℃條件下延伸10 min[16]。每個樣品獲得的PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳進(jìn)行檢測，并采用膠提取試劑盒(Sangon Biotech,China)進(jìn)行提純，提純后的PCR按照等摩爾比混合后送測序。

1.3 測序及數(shù)據(jù)分析

16S rRNA基因擴(kuò)增子測序和轉(zhuǎn)錄組測序在Illumina Hiseq 2000(Illumina Inc,USA)中完成。擴(kuò)增子測序結(jié)果按照QIIME分析流程進(jìn)行分析[17]，原始序列通過標(biāo)簽進(jìn)行分類，并采用QIIME pipeline對序列質(zhì)量進(jìn)行修整，嵌合子序列采用Uchime algorithm進(jìn)行去除，所得到的高質(zhì)量序列以97%的序列相似性閾值處理生成OTUs(操作分類單元)，并利用RDP(核糖體數(shù)據(jù)庫項目)分類器進(jìn)行分類分析樣品中群落結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在在線數(shù)據(jù)處理平臺—MG-RAST中進(jìn)行分析。大致流程為：上傳到MG-RAST數(shù)據(jù)庫中的FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，在初步質(zhì)量控制后，通過“join paired ends”選項將來自于同一樣品的兩個數(shù)據(jù)文件合并在一起。測序過程所產(chǎn)生的錯誤序列通過Gomez-Alvarez等所提到的方法進(jìn)行去除[18]。低質(zhì)量的序列通過modified dynamictrim方法進(jìn)行去除[19]。功能基因的微生物來源分析主要通過將測序數(shù)據(jù)與MG-RAST中的M5NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對得到。而SEED Subsystems數(shù)據(jù)庫會對蛋白質(zhì)進(jìn)一步構(gòu)建一個代謝通路，被用來進(jìn)行功能分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮濃度對活性微生物群落結(jié)構(gòu)及豐富度的影響

通過主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA；見圖1)研究活性微生物群落結(jié)構(gòu)對不同氨氮濃度的響應(yīng)。結(jié)果顯示，R1，R2和R3各個氨氮濃度條件下的微生物聚為一類，表明氨氮濃度對原核微生物群落組成影響較大，不同氨氮濃度反應(yīng)器種原核微生物群落組成不同。

圖1 厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中基于16S rRNA的主坐標(biāo)分析

通過對Observed OTUs, Chao 1 指數(shù)和PD whole tree指數(shù)計算研究原核微生物群落多樣性以及某些特定微生物群落活性隨氨氮濃度的變化測序深度統(tǒng)一為9190條序列。結(jié)果顯示微生物多樣性指數(shù)隨氨氮濃度的增加而增大(見表1)，且在不同氨氮濃度條件下表現(xiàn)出顯著差異。結(jié)果表明高氨氮使厭氧系統(tǒng)形成了新的生態(tài)位[20]。在高氨氮濃度下微生物種類可能增加，但不同微生物的相對豐度降低，某些微生物失去優(yōu)勢。

表1 不同氨氮濃度反應(yīng)器微生物的多樣性

注：每行數(shù)字后面的字母表示在p=0.05水平上的顯著差異

2.2 活性原核微生物群落組成及其表達(dá)分析

在本次實驗中，通過擴(kuò)增子測序測定了16S rRNA基因的V4區(qū)域，以揭示發(fā)酵系統(tǒng)中微生物在門、屬水平上的群落組成。結(jié)果見表2。

表2 基于16S rRNA主要微生物群落的相對豐度以及與氨氮濃度的相關(guān)性

結(jié)果顯示，厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度隨氨氮濃度增加而增加，在R1，R2和R3中相對豐度分別為33.8%，37.5%和53.7%(見表2)。厚壁菌門中的消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)，Peptoniphilus，梭菌屬(Clostridium)，Sporanaerobacter，Tepidimicrobium的相對豐度隨氨氮濃度增加而增大，與氨氮濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)；而乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，纖維桿菌屬(Fibrobacter)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的相對豐度隨氨氮濃度增加而降低，與氨氮濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(見表2)。變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度隨氨氮濃度增加而增大，其代表性屬Desulfobulbus與氨氮濃度表現(xiàn)出顯著正相關(guān)。擬桿菌門(Bacteroidetes)在R2中其相對豐度為最大，為48.2%，而在R1和R3中，其相對豐度相對較低，分別為33.4%和31.1%，其代表性屬Ruminofilibacter與氨氮表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)?；I菌門(Synergistetes)和螺旋體門(Spirochaetes)及其代表性屬與氨氮濃度無顯著相關(guān)性?；I菌門(Synergistetes)及其主要屬Aminobacterium與在R2中的相對豐度達(dá)到最大，而螺旋體門(Spirochaetes)及其主要屬Treponema表現(xiàn)出相反的變化趨勢。

對3組樣品總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，研究氨氮對厭氧反應(yīng)器微生物基因表達(dá)的影響。結(jié)果見表3。

表3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主要細(xì)菌群落相對豐度及其與氨氮濃度的相關(guān)性

對不同功能基因的微生物來源分析結(jié)果顯示，厚壁菌門(Firmicutes)的功能基因在每個反應(yīng)器中占據(jù)了主要地位(見表3)，且其變化趨勢與16S rRNA測定結(jié)果中的變化趨勢相一致，表明高氨氮濃度有利于基因表達(dá)的進(jìn)行，從而使其具有較高的活性。擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度隨氨氮濃度增加而降低，表明其對氨氮濃度較敏感，基因表達(dá)受到抑制。變形菌門(Proteobacteria)在R2中的相對豐度最大，可以看出其對氨氮有一定的耐受性，但氨氮超過一定濃度范圍時基因表達(dá)受到抑制。門水平上微生物在16S rRNA和mRNA中的差異表明不同微生物在不同氨氮濃度條件下基因的表達(dá)情況和代謝活躍程度具有顯著的差異。

而轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測定的各個屬中，Clostridium,Lactobacillus,Faecalibacterium,Listeria和Parabacteroides隨氨氮濃度變化表現(xiàn)出了顯著性差異(見表3)，其中，只有Clostridium與氨氮濃度成顯著正相關(guān)，其余屬與氨氮濃度成顯著負(fù)相關(guān)。表明氨氮對大多數(shù)屬的微生物活性基因的表達(dá)和代謝活躍程度具有抑制效應(yīng)，而高氨氮濃度條件下乙酸的積累促進(jìn)了Clostridium這種轉(zhuǎn)化乙酸、乳酸的微生物的基因表達(dá)和代謝活性[23-24]。

2.3 細(xì)菌群落的功能基因分析

在MG-RAST數(shù)據(jù)庫的子系統(tǒng)M5NR中對功能基因進(jìn)行注釋[25]。根據(jù)這些基因編碼蛋白的生物化學(xué)功能，我們將所有的功能基因在3個水平(level 1, levle 2, level 3)上進(jìn)行分組。

圖2 level 1水平上功能基因表達(dá)差異。

在level1上(見圖2)，RNA metabolism的相對豐度最高，在R1，R2和R3中，其相對豐度分別為25.4%，32.5%和22.9%。Carbohydrates，Protein metabolism與Amino Acids and Derivatives具有相同的規(guī)律，在R2中相對豐度最小，在R1和R3中的相對豐度較大；Dormancy and Sporulation與Cell Wall and Capsule的相對豐度隨著氨氮濃度的增加而增大；而Miscellaneous，DNA Metabolism以及Cell Division and Cell Cycle的相對豐度則隨氨氮濃度增加而降低。

RNA Metabolism是分解代謝生化反應(yīng)基因與酶之間的橋梁，其相對豐度變化趨勢表明一定氨氮濃度有利于代謝過程的進(jìn)行，過高或過低的氨氮濃度會影響反應(yīng)過程的進(jìn)行；Carbohydrates，Protein metabolism以及Amino Acids and Derivatives通常存在富含蛋白質(zhì)和多糖的反應(yīng)器中[26]，其相對豐度變化趨勢表明在R1和R3中，氮含量過低或過高，抑制了反應(yīng)過程的順利進(jìn)行，造成了蛋白質(zhì)和多糖的積累，因此其相應(yīng)的代謝功能基因增加[27-28]；Dormancy and Sporulation與Cell Wall and Capsule屬于厚壁菌門，具有與厚壁菌門相同的變化趨勢，且該功能基因主要與孢子生殖及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)[29]，結(jié)果表明，生殖方式與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)會影響微生物對氨氮濃度的耐受性；Miscellaneous、DNA Metabolism以及Cell Division and Cell Cycle的變化趨勢則表明高氨氮濃度可能會抑制細(xì)胞的形成。

圖3 level 2水平上功能水平表達(dá)分析

在level2上(見圖3)，Spore DNA protein，Oxidation stress，Lysine，threonine，methionine and cysteine以及Fermentation的相對豐度均隨著氨氮濃度的增加而增大，表明高氨氮濃度影響了細(xì)胞的正常生理功能，微生物中的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制開始啟動，各種抑制細(xì)胞凋亡的功能蛋白開始增加，以保護(hù)微生物免受氧化損傷[30-31]；而Plant-Prokaryote DOE project的相對豐度則隨著氨氮濃度的增加而降低。Protein biosynthesis，Central carbohydrate metabolism，Monosaccharides，F(xiàn)lagellar motility in prokaryota在R2中的相對豐度較低，表明在氨氮為5500 mg·L-1時有利于反應(yīng)的進(jìn)行，該結(jié)果與之前的研究結(jié)果相一致[32]。

圖4 level 3水平上功能水平表達(dá)分析

在level3上(見圖4)，Group Ⅱ intron-associated genes在R1，R2和R3中的相對豐度最高，分別為22.6%，30.2%和20.3%。其次是Small acid-soluble spore proteins，該種功能基因?qū)π菝咂谘挎叩挚雇饨绱碳ず捅苊庋挎咚劳鼍哂兄匾饔肹33]，其相對豐度隨氨氮濃度增加而增大；Methanogenesis，Ribosome LSU bacterial的相對豐度則隨著氨氮濃度的增加而降低。從這3個水平功能基因的變化趨勢可以看出，高氨氮會對發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用，在高氨氮水平下，與微生物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的功能基因以及抵抗外界刺激的功能基因的相對豐度增加。

2.4 甲烷生成過程的功能基因分析

通常，產(chǎn)甲烷過程主要有乙酸營養(yǎng)型代謝途徑、氫營養(yǎng)型代謝途徑和甲基營養(yǎng)型代謝途徑[34-35]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，反應(yīng)器中甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)占主導(dǎo)地位(見表3)，且相對豐度隨氨氮濃度增加而增大；氫型的甲烷囊菌屬(Methanoculleus)次之，其次為甲基和氫混合型的第七產(chǎn)甲烷古菌屬(Methanomassillicoccus)[36]。在我們的系統(tǒng)中，氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型代謝途徑的酶基因來自于不同微生物(具有最大相對豐度的編碼酶的基因)(見表4)。在乙酸代謝途徑中，編碼ACK，PTA以及ACS的基因都來源于產(chǎn)甲烷古菌Methanoculleus和Methanosarcina；而編碼CDH的基因在對照組中主要來源于Bacteroides，在高氨氮濃度的反應(yīng)系統(tǒng)中，主要來源于Syntrophomonas。在氫營養(yǎng)代謝途徑中，編碼各種酶的基因主要來源于產(chǎn)甲烷古菌Methanoculleus和Methanosarcina。

盡管很多研究者認(rèn)為，在高氨氮條件下，甲烷形成主要通過氫營養(yǎng)代謝途徑轉(zhuǎn)化H2和CO2而形成甲烷[37]。然而，在本研究中，乙酸代謝途徑與氫營養(yǎng)代謝途徑在各個反應(yīng)器中均存在。乙酸代謝途徑中，限制代謝速度的酶ACS在高氨氮條件下相對豐度更大，表明乙酸代謝途徑在高氨氮濃度具有更高的代謝活性，與乙酸型的產(chǎn)甲烷古菌相對豐度變化趨勢相一致；而氫營養(yǎng)代謝途徑中的MCH酶活性在對照組中明顯高于高氨氮濃度反應(yīng)系統(tǒng)中的活性(見表4)，表明高氨氮濃度會對氫營養(yǎng)途徑形成甲烷具有抑制作用。共同代謝途徑的兩種酶tetrahydromethanopterin S-methyltransferase (MTR) 和 methyl coenzyme M reductase (MCR) 的相對豐度表現(xiàn)出隨氨氮濃度的增加而降低的趨勢。在R1和R2反應(yīng)器中，Methanoculleus是產(chǎn)甲烷古菌中MTR和MCR酶的主要貢獻(xiàn)者，但是在R3反應(yīng)系統(tǒng)中，MTR和MCR酶的主要貢獻(xiàn)者則主要是Methanoculleus和Methanosarcina。這些結(jié)果表明，高氨氮濃度對產(chǎn)甲烷過程具有抑制作用；不同氨氮濃度條件下，兩種產(chǎn)甲烷代謝途徑均存在，且乙酸途徑占據(jù)主導(dǎo)地位。

表4 轉(zhuǎn)錄組分析催化乙酸代謝途徑和氫營養(yǎng)代謝途徑中編碼特定酶的相對豐度 (%)

3 結(jié) 論

綜上，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的高氨氮濃度會改變活性微生物的群落結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)活性。高氨氮濃度條件下，Ruminofilibacter和Lactobacillus向Clostidium和Peptostreptococcus轉(zhuǎn)變，活性微生物的多樣性都顯著增加，表明在高氨氮濃度條件下形成了新的特定生態(tài)位。高氨氮濃度也會改變功能基因的表達(dá)水平，高氨氮濃度條件下與孢子生殖和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的代謝過程基因，如Dormancy and Sporulation和Cell Wall and Capsule會增加，而與細(xì)胞生長代謝相關(guān)的基因，比如Cell Division and Cell Cycle和Miscellaneous會減少。產(chǎn)甲烷過程中相應(yīng)酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸減少，表明高氨氮將抑制產(chǎn)甲烷過程的進(jìn)行，但高氨氮系統(tǒng)中乙酸代謝途徑具有更高的代謝活性，乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑占據(jù)主導(dǎo)地位。這些結(jié)果說明，微生物的群落結(jié)構(gòu)和代謝過程會隨著氨氮濃度的變化而出現(xiàn)適應(yīng)性的改變。