周秀蓉，肖霜艷，2，康樺華，陳小文，呂殿紅，溫肖會，翟頎，賈春玲，翟少倫*，魏文康*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站 廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 武漢 430000；3.四會市畜牧獸醫(yī)局 廣東肇慶 526200）

目前，研究庫布病毒大部分是基于病原特征以及基因組特征來進行分子生物學技術(shù)以及血清學等方面的研究。本文旨在通過對庫布病毒的研究進展進行闡述，希望對廣大研究者有所幫助。

1 病毒的發(fā)現(xiàn)

庫布病毒的首次發(fā)現(xiàn)可追溯到1989年，日本科研人員在日本愛知縣的急性胃腸炎病人糞便樣本中發(fā)現(xiàn)庫布病毒，因在愛知縣被發(fā)現(xiàn)，又名愛知病毒（Aichivirus）[1]。2003 年，Yamashita 等[2]在實驗室體外培養(yǎng)HeLa 細胞的過程中，庫布病毒被當成一種細胞因子被發(fā)現(xiàn)，通過檢測和分析發(fā)現(xiàn)，庫布病毒粒子來源于培養(yǎng)細胞用的胎牛血清，因此被命名為牛庫布病毒。2007 年，在匈牙利和中國的腹瀉仔豬糞便中檢測到了豬庫布病毒[3]。2010 年，在匈牙利家養(yǎng)綿羊糞便中，檢測到了羊庫布病毒陽性[4]。自從2007 年首次在中國腹瀉仔豬糞便中分離出庫布病毒，國內(nèi)對該病毒的研究越來越多，逐漸發(fā)現(xiàn)庫布病毒在我國廣泛流行分布。

庫布病毒被認為是國內(nèi)的新發(fā)病原，初期研究發(fā)現(xiàn)其在腹瀉動物糞便樣本中可以被檢測出來，因此推測其與動物的腹瀉關(guān)系密切；隨著對庫布病毒的研究，對其的認識愈加全面。Reuter 等[5]發(fā)現(xiàn)，庫布病毒可在野豬糞便樣本中檢測到。Jin 等[6]在健康動物糞便及血清中也檢測到了庫布病毒。綜上，從多個研究結(jié)果中可推測庫布病毒不僅作用于腸道細胞，可能還能穿過血管壁到達血液中，由此可見，庫布病毒的致病機制較為復雜。此外，通過國內(nèi)外的研究表明，庫布病毒不僅感染動物，還感染人。通過對庫布病毒的基因組序列的研究與分析可知，不同地區(qū)、不同物種、不同個體的庫布病毒毒株的基因組序列存在著很大的差異。綜合國內(nèi)外所面對的動物衛(wèi)生安全環(huán)境，基于庫布病毒的變異性較大，因此在疫苗研制方面沒有較大的實際意義。

2 病毒的分類

自1989 年發(fā)現(xiàn)庫布病毒以來，科研人員逐步在豬牛羊等動物中檢測到庫布病毒。隨著對庫布病毒研究的增多，發(fā)現(xiàn)庫布病毒除了人、牛、豬三種宿主以外，還感染犬、貓、鼠、綿羊等動物[4,7,8]。因此，在國際病毒分類委員會公布的第十次病毒分類報告中將庫布病毒進行了分類，根據(jù)病毒所感染的宿主不同，以及基因同源性，分為Achivirus A、B、C、D、E、F 六類[9,10]。

牛、羊庫布病毒（Bovine/Ovine kobuvirus BKoV/OKoV）根據(jù)對其基因組序列和遺傳進化分析，將二者歸納于B 型愛知病毒。2003 年，在日本一實驗室中發(fā)現(xiàn)了第一株牛的庫布病毒，其被命名為U-1 毒株（GenBank 登錄號，AB084788.1）[2]。U-1 毒株全長基因組為8374nt。U-1 毒株是在實驗室培養(yǎng)細胞的過程中被當作一種細胞誘變劑而發(fā)現(xiàn)的。通過對其基因組和病毒粒子特性分析，將其歸納于B 型愛知病毒，這種“細胞誘變劑”來源于用于培養(yǎng)細胞的胎牛血清。另有研究發(fā)現(xiàn)從黑牛體內(nèi)分離得到一株庫布病毒不屬于B 型愛知病毒，而被歸類于D型愛知病毒。由此可見相同物種中感染的庫布病毒可能不屬于同一種病毒類型[11]。2018 年，F(xiàn)akry F 等[12]首次報告了埃及牛群中的BKoV 感染情況，其中埃及BKoV 毒株（GenBank 登錄號，KY407744.1）基因組長度為8319nt，與U-1 毒株在核酸和氨基酸水平上同源性分別為89.5%和96.3%；與綿羊庫布病毒[A]（Gen-Bank 登錄號，GU245693.2）在核酸和氨基酸水平上同源性分別為81.5%和86.2%。2011 年，從韓國黑山羊的糞便中，檢測到了庫布病毒（GenBank 登錄號，JF714211.1）[13]。將該病毒進行全基因組測序以及進行基因序列的同源性比對和遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)羊庫布病毒與牛庫布病毒具有較高的同源性，因此將羊庫布病毒也歸類于B 型愛知病毒。

豬庫布病毒（Porcine kobuvirous，PKoV）是C 型愛知病毒的唯一成員，該病毒與牛羊源庫布病毒基因序列及結(jié)構(gòu)有較大的差異。2008 年，在匈牙利的豬群糞便樣品中檢測到庫布病毒，通過對該毒株（Kobuvirus/swine/S-1-HUN/2007/Hungary）（GenBank登錄號，EU787450.2）基因組進行分析，將該病毒暫時歸類于C 型愛知病毒[3]。該毒株基因組大小約為8.2kb。Zhai 等[14]研究發(fā)現(xiàn)一株新型的PKoV，與S-1-HUN 株對比，其在2B 區(qū)域缺失了30 個氨基酸。

在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，從同一宿主中可以分離出多株不同庫布病毒毒株。此外，從帶毒豬/牛中可能分離得到基因組與BKoV/PKoV 基因組相似度更高的毒株。

3 病毒基因組特征

庫布病毒（Kobuvirus，KBV）是微小RNA 病毒科庫布病毒屬成員，無囊膜的單股正鏈RNA 病毒，直徑約為30nm，病毒粒子為球形的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，表面有很多凸起[15]?；蚪M大小為8.2～8.3kb。庫布病毒基因組中GC 的含量高達59%。其3'UTR 端非常長，最長可達240bp，5'端復雜的二級結(jié)構(gòu)涉及RNA 復制和衣殼化[16]。

庫布病毒全基因組具有小RNA 基因組特征，全基因組被分為兩部分，包括非編碼區(qū)和編碼區(qū)。非編碼區(qū)包括5'端的UTR 區(qū)和3'端的UTR 區(qū)；5'端有一個編碼VPg 小分子蛋白的區(qū)域，該蛋白主要充當引物參與RNA 的復制；3' 端有一個較長的富含A 的ployA 尾[15]。編碼區(qū)有一個較大的開放閱讀框ORF，近5'端有一個前導蛋白L 的編碼區(qū)，以及編碼一個多聚蛋白；多聚蛋白可以裂解為三個結(jié)構(gòu)蛋白和七個非結(jié)構(gòu)蛋白。將該區(qū)域分為P1、P2、P3 三個區(qū)域，P1 編碼結(jié)構(gòu)蛋白包括VP0、VP3、VP1，參與病毒衣殼蛋白的合成；P2、P3 編碼2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 七種非結(jié)構(gòu)蛋白[16,17,18]。其VP1 蛋白具有良好的免疫源性，VP1 基因突變率較高，常發(fā)生同源重組[19]。3D 序列為庫布病毒的保守序列，因此常針對3D序列設計引物，檢測庫布病毒。

4 流行病學

牛庫布病毒（Bovine Kobuvirus，BKoV）最早被發(fā)現(xiàn)于胎牛血清中，通過血清學方法在72 份牛血清中檢測出42 份為庫布病毒陽性（59.2%）[2]。后來，在國內(nèi)外相繼有在牛糞便中檢測到庫布病毒的報道。在對泰國、韓國、比利時、匈牙利、荷蘭、意大利和巴西等多個國家的流行情況研究發(fā)現(xiàn)，BKoV 的總流行率在1%～40%之間。2008—2010 年，韓國患腹瀉牛群中的BKoV 檢測率為34.6%～36.1%（37/107～13/36），而犢牛（66.7%）中的BKoV 檢出率明顯高于青年牛（25.0%）和奶牛（18.4%）[20,21]。意大利腹瀉牛糞便樣品中BKoV 的檢出率為4.9%（7/142）[22]。巴西BKoV 檢出率14.4%（31/216），并發(fā)現(xiàn)幼仔感染率最高，隨年齡增長呈下降趨勢；1 個月的犢牛為82.6%（19/23），年齡較大的犢牛為38.5%（5/13）[23]。埃及BKoV 檢出率為66.7%（24/36）[24]。中國檢出率為1%～34.9%，其中，Chang 等[25]收集了來自中國四個主要奶牛產(chǎn)區(qū)中腹瀉牛的166 個糞便標本，通過RT-PCR 檢測BKoV，BKoV 陽性率為34.9%（58/166）。師志海等[26]在建立牛嵴病毒與牛諾如病毒雙重PCR 檢測方法中，檢測了127 份腹瀉牛糞便樣品，BKoV 檢出率為4.72%（6/127）。此外，最近在匈牙利的家養(yǎng)綿羊和韓國的黑山羊中也發(fā)現(xiàn)了類似BKoV[4,27]，這表明B 型愛知病毒在反芻動物包括牛、羊群體中具有世界性的分布。

豬庫布病毒最早在匈牙利被發(fā)現(xiàn)，在隨后的報道中表明，在美國、匈牙利、意大利、捷克、荷蘭、巴西、中國、韓國、日本和泰國等國的豬群中廣泛分布著PKoV。PKoV 在腹瀉和健康豬中均能被檢測出，該病毒的陽性率從3.9%～100%不等。據(jù)報道，在匈牙利野豬中發(fā)現(xiàn)了高流行的PKoV（100%），這一發(fā)現(xiàn)表明，野豬也可能是PKoV 的重要宿主[5]。Chu 等[28]通過RT-PCR 方法檢測了在2009—2013 年期間在泰國北部仔豬群收集的636 個糞便樣品，腹瀉仔豬中和無癥狀仔豬中檢測出庫布病毒陽性率分別為95.6%（505/528）和96.3%（104/108），由此可知，泰國北部仔豬普遍感染PKoV。2010 年，Wang 等[29]對上海三個豬場收集的116 例糞便樣本進行了篩查，發(fā)現(xiàn)PKoV 感染率為38.8%（45/116）。Chen 和Wang 等[19,30]對中國四川省、甘肅省PKoV 的流行現(xiàn)狀進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PKoV 的檢出率分別為53%（87/163）和62.1%（126/203），其中腹瀉樣品中豬庫布病毒總檢出率為64.3%，無癥狀豬的PKoV的感染率為29.4%（15/51）。張沙等[31]利用RT-PCR 方法對2011、2012 年期間來自中國27 個省市126 個豬場的病料共計448 份進行了3D 基因的檢測，PKoV 陽性率為25.0%，豬場陽性率為40.48%（51/126）。Mai 等[32]在對豬博卡病毒進行流行病學調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)PKoV 的感染率高達68.7%。2017 年，Zhai 等[14]調(diào)查國內(nèi)某豬場對庫布病毒的感染率，發(fā)現(xiàn)竟高達90%，且伴隨著中度博卡病毒1 型感染。王瑋等[33]對山東省2014—2016 年冬采集的350份病料樣品進行RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示，在350 份病料樣品中，PKoV 陽性率為56%（196/350），陽性豬場占80%（24/30）；非腹瀉豬個體陽性率（65.38%，153/234）明顯高于腹瀉豬個體陽性率（37.07%，43/116）；育肥豬的PKoV 陽性率（97.50%）遠高于哺乳期仔豬（45.40%）、斷奶期仔豬（52.75%）以及成年豬（66.67%）；夏秋季節(jié)采集的樣品PKoV 檢出率（71.94%）明顯高于冬春季節(jié)（45.50%）。統(tǒng)計PKoV 與PEDV、TGEV 混合感染結(jié)果顯示，雖然PKoV 在非腹瀉豬群中單獨感染率（61.11%，143/234）遠高于腹瀉豬群(18.97%，22/116)，但非腹瀉豬群PKV 與PEDV 和TGEV 的混合感染率卻明顯低于腹瀉豬群。劉占旭等[34]在建立RAP 快速診斷PKoV 方法的過程中，對2016—2017 年采自河南、新疆、黑龍江等地的276 份臨床豬腹瀉樣品進行檢測，PKoV 的檢出率為58.7%。楊振等[35]對江蘇省七個縣域豬嵴病毒感染的流行病學調(diào)查結(jié)果表明所有樣品豬嵴病毒感染陽性率達52.73%（116/220），陽性豬場占79.41%（27/34）。由以上研究表明，PKoV 在國內(nèi)的流行范圍較為廣泛，且感染率較高，不僅感染家豬還感染野豬，且不同年齡階段豬群的感染率不一致。同時PKoV 的感染呈現(xiàn)出典型的季節(jié)特性，但無區(qū)域特性。無癥狀豬與腹瀉豬均可檢測到PKoV，且常伴隨著多種病毒混合感染。

5 病毒與疾病的相關(guān)性

Yang 等[36]通過建立健康仔豬模型，然后對該模型仔豬進行單一變量的攻毒試驗；作用一段時間后，將不同的組織器官進行病理學研究，結(jié)果表明庫布病毒可引起肺、胃、小腸等器官不同程度的細胞脫落、淋巴細胞聚集等炎癥反應。由此可見，庫布病毒在機體的定植范圍較為廣泛。此外，大多數(shù)攜帶有豬庫布病毒、牛庫布病毒與羊庫布病毒的動物可能表現(xiàn)為腹瀉、消瘦、惡心等臨床癥狀；有部分攜帶者并不表現(xiàn)出任何的臨床癥狀。因此KBV 是否致病目前尚沒有直接的證據(jù)證明，但是PKoV 在豬群中感染率很高，不僅感染患病豬群，健康豬糞便中也可以檢測到豬庫布病毒，由此可以推測庫布病毒在動物體內(nèi)的長期存在能致使宿主患病。另有研究表明，動物感染庫布病毒的同時，亦會感染其他病毒，例如豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬星形病毒、豬輪狀病毒和豬博卡病毒等[37,38,39]，可推測庫布病毒可能與其他病毒共同作用于動物機體，從而對動物機體造成不同程度的損傷。

6 病毒的培養(yǎng)與檢測

6.1 病毒的培養(yǎng)

在2003 年的一項研究中表明，牛庫布病毒可以使HeLa 細胞產(chǎn)生細胞病變（CPE），但是無法從該細胞中分離得到病毒[2]。目前對PKV 易感細胞系的研究表明，PKV 無法導致HeLa 細胞、Vero細胞、PK-15 細胞、MDBK 細胞、Mac-145 細胞、ST 細胞、RD 細胞等細胞系產(chǎn)生CPE。但是PKV 在Vero 細胞系盲傳6 代或者11代后，無法檢測到豬庫布病毒[40]，由此推測可能檢測到的是接種的病毒核酸，而PKV 可能不在Vero 細胞中復制。在目前對豬庫布病毒的研究中還未找到PKV 的易感細胞系。

6.2 病毒的檢測

6.2.1 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶鏈式反應檢測方法常用于病原的遺傳進化分析以及各種動物疫病的檢測，該檢測是以分子生物學為基礎(chǔ)，建立起來的一種簡便、快速的方法。該方法敏感性、特異性和重復性較好。庫布病毒屬于RNA 病毒，因此檢測該病毒需要使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（Revers Transpersiton PCR，RT-PCR）。2007 年匈牙利科學家就是通過RT-PCR 方法檢測豬庫布病毒。隨著庫布病毒全基因組序列被公開，大多數(shù)研究者基于庫布病毒的3D 序列設計三種病毒的通用檢測引物，可以用于檢測不同動物源庫布病毒。孟麗等[41]根據(jù)多種腹瀉病毒基因組建立了多重PCR 法，該研究中PKV 陽性率最高，為26.98%（2015 年）和45.79%（2016 年）。胡軍勇等[42]建立了多重RT-PCR 法檢測多種腹瀉病毒，其敏感度為180fg/mL、特異性良好，不會和其他病毒模板發(fā)生非特異擴增。

6.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time Polymerase Chain Reaction）隨著科學技術(shù)的進步與發(fā)展，實時熒光定量PCR 逐漸被應用于臨床檢測。Real-time PCR 的敏感性、特異性以及重復性都要優(yōu)于普通PCR，且其檢測限較低，這樣可以更加準確地檢測和判斷動物機體是否感染庫布病毒。同時，Real-time PCR操作簡單方便，可以實時監(jiān)控擴增過程中基因拷貝數(shù)的變化，與普通PCR 比較，省略了凝膠電泳的步驟，可以減少大量時間。Real-time PCR 檢測方法不僅能夠進行定性檢測還能進行定量檢測，其產(chǎn)物同樣也可以進行膠回收等試驗。劉孟良等[43]建立了SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR 法，其擴增效率可達到91.8%，檢測出的最低拷貝數(shù)為100 拷貝。謝榮輝等[44]建立的豬庫布病毒Taq Man 熒光定量RT-PCR 檢測方法能特異性檢測豬庫布病毒，與其他引起豬腹瀉的病毒無交叉反應，對標準質(zhì)粒檢測靈敏度達10 copies/μL；模板終濃度在107～10copies/μL 范圍內(nèi)時，與標準曲線Ct 值有良好的線性關(guān)系；Real-time RT-PCR 陽性檢出率（30.94%）高于普通RT-PCR（29.50%）。

6.2.3 重組酶聚合酶擴增（RPA）快速診斷方法 劉占旭等[34]建立了RPA 快速診斷方法，結(jié)果表明該方法對KBoV 最低檢測限度為3.36×102copies/μL 的質(zhì)粒DNA，該方法具有良好的敏感性。對208 份臨床豬糞便樣品進行了檢測，結(jié)果顯示，豬庫布病毒陽性率為73.1%，明顯高于常規(guī)RT-PCR 的46.6%，兩種方法的符合率為90.2%。

6.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）朱慶賀等[45]基于豬庫布病毒重組VP3 蛋白建立了間接ELISA 檢測方法，檢測55 份臨床血清樣品，其中28 份樣品為PKV 抗體陽性，而RT-PCR 檢測結(jié)果顯示有32 份樣品呈陽性，這兩種方法的符合率為90.3%。VP1 蛋白具有良好的免疫原性，田野[46]基于VP1 蛋白建立了間接ELISA 檢測方法，結(jié)果顯示我國華北地區(qū)PKV 感染率高達81.25%。

7 展望

自2008 年在我國豬糞便中檢測到庫布病毒以來，對庫布病毒的研究逐漸增多。在 2010—2018 年期間，研究熱度較高。但由于庫布病毒基因組在物種之間的差異性較大，且易發(fā)生變異，對該病毒的研究難度變大。由于還未找到豬庫布病毒的易感細胞系，導致在對病毒的分離上遇到了較大的阻礙。目前對庫布病毒的研究仍集中在對該病毒基因組的遺傳進化分析、檢測方法以及流行病學上的研究。雖然對該病毒的致病機制、感染性克隆、穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)等方面的研究不少，但突破性進展仍然很少。相信通過科研人員今后更加深入的研究，將逐步揭開庫布病毒的神秘面紗，從而獲得更多庫布病毒的科學知識。